Biochemische Charakterisierung und Reinigung eines in Spodoptera frugiperda (Sf 21) Zellen heterolog exprimierten spannungsabhängigen K+-Kanals:
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IN
HALTS
VERZEICHN
IS
ABKUERZUNGEN
.
1
1.
EINLEITUNG
.
3
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
6
2.
1
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
MATERIALIEN
.
6
2.2
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
8
2.3
DNA-TECHNOLOGIE
.
10
2.3.1
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
10
2.3.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
AUS
2
ML
KULTUREN
.
10
2.3.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
AUS
100
ML
UND
500
ML
KULTUREN
.
10
2.3.2
VERDAUUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
11
2.3.3
PRAEPARATION
VON
KLONIERUNGSVEKTOREN
.
11
2.3.4
AUFFUELL
UND
ABDAUREAKTION
.
12
2.3.5
GELELEKTROPHORESE
.
12
2.3.6
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
12
2.3.7
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
.
13
2.3.8
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
13
2.3.9
POLYMERASE
KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
14
2.3.10
NICHTRADIOAKTIVER
NACHWEIS
VON
DNA
.
14
2.3.10.1
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG
VON
DNA
.
14
2.3.10.2
HYBRIDISIERUNG
UND
NACHWEIS
VON
DNA
.
15
2.4
PROTEINEXPRESSION
IN
E.
COLI
.
17
2.4.1
INDUKTION
UND
AUFSCHLUSS
VON
PHE FUSIONSPROTEINEN
.
17
2.4.2
INDUKTION
UND
AUFSCHLUSS
VON
PGEX
FUSIONSPROTEINEN
.
17
2.4.3
INDUKTION
UND
AUFSCHLUSS
VON
PUR
FUSIONSPROTEINEN
.
18
2.4.4
ANALYTISCHE
SDS-PAGE
.
18
2.4.5
PRAEPARATIVE
SDS-PAGE
.
18
2.4.6
ELEKTROELUTION
.
19
2.5
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
19
2.5.1
PRAEPARATION
VON
IMMUNISIERUNGSPROBEN
UND
IMMUNISIERUNG
.
19
2.5.2
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
.
19
2.5.3
WESTEMANALYSEN
.
20
2.5.3.1
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROCELLULOSE-MEMBRANEN
.
20
2.5.3.2
ANTIKOERPERINKUBATIONEN
.
20
2.5.4
BESEITIGUNG
VON
KREUZREAKTIVITAETEN
.
21
2.5.5
AFFINITAETSREINIGUNG
.
21
2.5.6
EUSA-ASSAY
.
21
2.5.7
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
.
22
2.5.8
IMMUNCYTOCHEMIE
.
23
2.6
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
24
2.6.1
ZELLKULTUR
.
24
2.6.2
VIRUSINFEKTIONEN
.
24
2.6.3
TITERBESTIMMUNG
.
25
2.6.4
ISOLIERUNG
VON
ACNPV-DN
A.
.
25
2.6.5
TRANSFEKTION
VON
SF21
ZELLEN
.
26
2.6.6
ISOLIERUNG
REKOMBINANTER
VIREN
.
26
2.6.7
ISOLIERUNG
VON
VIRUS-DNA
AUS
PLAQUEELUATEN.
27
2.7
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
27
2.7.1
LYSE
DER
ZELLEN
.
27
2.7.1.1
ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
.
27
2.7.1.2
HYPOTONELYSE
.
28
2.7.1.3
"PARR"-BOMBEN
AUFSCHLUSS
.
28
2.7.2
PRAEPARATION
VON
MEMBRANEN
.
28
2.7.3
SOLUBILISIERUNG
.
29
2.7.4
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
29
2.7.5
LONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
.
30
2.7.6
DEPHOSPHORYLIERUNG
.
30
2.7.7
DEGLYKOSYLIERUNG
.
30
3.
ERGEBNISSE
.
32
3.1
GEWINNUNG
VON
ANTI-RCKL
ANTISEREN
.
32
3.1.1
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
CYPHE
UND
CY-PGEX
.
32
3.1.2
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
NRPGEX
UND
NYPUR
.
34
3.1.3
INDUKTION
UND
AUFREINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.
36
3.1.4
IMMUNISIERUNG
UND
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
.
38
3.1.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANTISEREN
.
38
3.1.6
REINIGUNG
DER
ANTISEREN
.
39
3.2
HETEROLOGE
EXPRESSION
DES
RCKL-PROTEINS
MIT
HILFE
DES
BACULOVIRUS
EXPRESSIONSSYSTEMS
.
41
3.2.1
ISOLIERUNG
VON
ACNPV-DNA.
.
41
3.2.2
KONSTRUKTION
DES
RCK1
PVL
1393
TRANSFERVEKTORS
.
42
3.2.3
GENERIERUNG
UND
ISOLIERUNG
REKOMBINANTER
R
1
ACNPV
.
44
3.2.4
EXPRESSION
DES
RCK1
K
+
-KANALS
IN
SF
21
ZELLEN
.
47
3.2.5
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
.
50
3.2.5.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
.
51
3.2.5.2
DEGLYKOSYLIERUNG
.
53
3.2.6
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
AN
INFIZIERTEN
SF21
ZELLEN
.
55
3.2.7
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
RCK1
INSF21
ZELLEN
.
56
3.2.7
REKONSTITUTIONSEXPERIMENTE
.
58
3.3
AUFREINIGUNG
DES
RCK1
K
+
-KANALPROTEINS
.
63
3.3.1
PRAEPARATION
VON
MEMBRANEN.
63
3.3.2
SOLUBILISIERUNG
.
65
3.3.3
SUCROSEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
73
3.3.4
DMAE-SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
75
3.4
IMIMINCYTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DES
RCK1
PROTEINS
IM
RATTENGEHIRN
.
77
4.
DISKUSSION
.
82
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
94
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
95 |
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