Etablierung und Charakterisierung eines Flüssigkultursystems der Gartenerbse (Pisum sativum L.):
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALT SEITE
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 4
2.1 PFLANZENMATERIAL 4
2.1.1 MUTANTEN 4
2.1.2 REKOMBINANTEN 5
2.1.^ GENOTYPEN ANDERER HERKUNFT 7
2.2 METHODEN 9
2.2.1 KULTURMEDIEN 9
2.2.2 KALLUSKULTUR 10
2.2.2.1 ANZUCHT UND STERILISATION 10
2.2.2.2 KULTURBEDINGUNGEN 11
2.2.3 SUSPENSIONSKULTUR 12
2.2.3.1 INITIATION DER SUSPENSIONSKULTUREN 12
2.2.3.2 DAUERKULTUREN 13
2.2.3.3 KULTURBEDINGUNGEN 13
2.2.4 BIOREAKTOR 13
2.2.5 WACHSTUMS- UND VITALITAETSPARAMETER 16
2.2.5.1 FRISCHGEWICHT 16
2.2.5.2 TROCKENGEWICHT 16
2.2.5.3 GEPACKTES ZELLVOLUMEN 17
2.2.5.4 EINZELZELLZAHL 17
2.2.5.5 PH-WERT
17
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.5.6 SACCHAROSEGEHALT 18
22.5.1
WACHSTUMSRATE 18
2.2.5.8 MITTLERE PRODUKTIONSRATE 18
2.2.5.9 TETRAZOLIUMSALZ-REAKTION 19
2.2.5.10 EVAN'S BLUE 20
2.2.5.11 FLUORESCEINDIACETAT 20
2.2.6 PROTEINEXTRAKTION 20
2.2.6.1 EXTRAKTIONSPUFFER 20
2.2.6.2 PROBENAUFBEREITUNG 21
2.2.6.3 PROTEINBESTIMMUNG 22
I
2.2.7 GELELEKTROPHORESE 22
2.2.7.1
ELEKTROPHORESEEINRICHTUNG 22
2.2.7.2 NATIVES GELSYSTEM 23
2.2.7.2.1 ZUSAMMENSETZUNG DER GELE 23
2.2.7.2.2 HERSTELLUNG UND DURCHFUEHRUNG 24
2.2.7.3 SDS-PAGE, 25
2.2.7.3.1 ZUSAMMENSETZUNG DER GELE 25
2.2.12.2
MOLEKULARGEWICHTSMARKER 27
2.2.7.3.3 FAERBUNG DER SDS-GELE 27
2.2.8 ENZYMTESTS 28
2.2.8.1 DEHYDROGENASEN 28
2.2.8.1.1 LOESUNGEN UND DURCHFUEHRUNG 28
2.2.8.1.2 REAKTIONSPRINZIP 30
2.2.8.1.3 NACHWEISPRINZIP 31
2.2.8.2 HYDROLASEN UND TRANSFERASEN 32
2.2.8.2.1 LOESUNGEN UND DURCHFUEHRUNG 32
2.2.8.2.2 REAKTIONSPRINZIP 33
2.2.8.2.3 NACHWEISPRINZIP 35
2.2.9 GELFOTOGRAPHIE 35
2.2.10 DENSITOMETRIE DER GELFAERBUNGEN 36
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 37
2.3.1 PRAEPARATION DER DNA 37
2.3.1.1 DNA-ISOLATION (NACH DOYLE 1991) 37
2.3.1.2 REINIGUNG DER DNA 38
2.3.1.3 KONZENTRATIONS-UND REINHEITSBESTIMMUNG DER DNA 38
2.3.1.3.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER DNA 38
2.3.1.3.2 DNA-MENGENBESTIMMUNG IM AGAROSEGEL 39
L
2.3.2 RESTRIKTIONSVERDAU 39
2.3.2.1 RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN 40
2.3.3 DNA-GELEKTROPHORESE 41
2.3.4 SOUTHEM-T RANSFER 42
2.3.5 HYBRIDISIERUNG DER NYLONMEMBRAN 43
2.3.6 DETEKTION DER DNA-FRAGMENTE 44
3. ERGEBNISSE 46
3.1 SUSPENSIONSKULTUREN IN SCHUETTELKULTUR 46
3.1.1 ANLEGEN VON SUSPENSIONS-DAUERKULTUREN 46
3.1.2 OPTIMIERUNG DES KULTURMEDIUMS 54
3.1.2.1 BASISMEDIEN 54
3.1.2.2 PHYTOHORMONE 55
3.1.2.3 SACCHAROSE 57
3.1.3 GENOTYPSPEZIFISCHES WACHSTUMSVERHALTEN IN 58
SUSPENSIONSKULTUR
3.1.4 VERGLEICH DES WACHSTUMS DER AUS BLATT-BZW. 64
WURZELKALLUS INITIERTEN SUSPENSIONEN
3.1.5 WACHSTUMSVERHALTEN VON SUSPENSIONSKULTUREN IN 64
SCHUETTELKULTUR
3.1.6 WACHSTUMSVERHALTEN VON SUSPENSIONSKULTUREN IM 68
BIOREAKTOR
3.1.7
VERGLEICH DES WACHSTUMS IN SCHUETTELKULTUR UND
71
BIOREAKTOR
3.1.8 VITALITAET DER SUSPENSIONSKULTUREN 75
3.1.8.1 T
ETRAZOLIUMSALZ-REAKTION
7 5
3.1.8.2 LEBENDZELLZAHLBESTIMMUNG MIT FDA UND EVAN'BLUE 77
3.2 BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN DER 80
SUSPENSIONSKULTUREN
3
.
2
! 1 GENETISCHE STABILITAET DER SUSPENSIONSKULTUREN 80
3.2.2 VERGLEICH DER HELL- UND DUNKELKULTIVIERUNG 86
3.2.3 PROTEINEXPRESSION IM VERLAUF EINER KULTIVIERUNGSPHASE 86
3.2.4 EINFLUSS DER VERWENDETEN CYTOKININE AUF DIE 86
PROTEINEXPRESSION
3.3 MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN 87
3.3.1 DNA-ISOLATION UND RESTRIKTIONSVERDAU 87
3.3.2 DNA-FINGERPRINTING 89
3.3.2.1 HYBRIDISIERUNG MIT DEN SONDEN (GACA)
4 UND (GTG), 89
3.3.2.2 HYBRIDISIERUNG MIT DER SONDE (GATA) 89
4. DISKUSSION 99
5. ZUSAMMENFASSUNG H4
6. LITERATURVERZEICHNIS 116 |
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