Chromatinstruktur und Transkriptionsaktivität am Beispiel des konstitutiven Profilingens:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
I.
EINLEITUNG
1
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
18
1.
MATERIALIEN
18
1.1.
FEINCHEMIKALIEN
UND
BEZUGSQUELLEN
18
1.2.
ENZYME
20
1.3.
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
21
1.4.
VEKTOREN
21
1.5.
E.
COLI-STAEMME
21
1.6.
S.
CEREVISIAE-STAEMME
22
1.7.
HELFERPHAGE
22
1.8.
NAEHRMEDIEN
22
1.9.
OLIGONUKLEOTIDE
24
2.
METHODEN
26
2.1.
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
VON
DNA
26
2.1.1.
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
26
2.1.2.
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
AUS
S.
CEREVISIAE
26
2.1.3.
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRANG-DNA
AUS
E.
COLI
26
2.1.4.
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
HEFE
27
2.1.5.
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
27
2.2.
GELELEKTROPHORESEVERFAHREN
27
2.2.1.
AUFTRENNUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
IM
AGAROSEGEL
27
2.2.2.
AUFTRENNUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
IM
POLYACRYLAMIDGEL
28
2.2.3.
PROTEINGELELEKTROPHORESE
28
2.3.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
28
2.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
DER
GELMATRIX
29
2.5.
LIGATION
VON
DNA-MOLEKUELEN
29
2.5.1.
PHOSPHATASEBEHANDLUNG
LINEARER
DNA-MOLEKUELE
29
2.5.2.
LIGATION
29
2.6.
T
RANSFORMATIONSMETHODEN
30
2.6.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI-ZELLEN
30
2.6.1.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI-ZELLEN
30
2.6.1.2.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI-ZELLEN
30
2.6.2.
TRANSFORMATION
VON
HEFEZELLEN
30
2.7.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
31
2.8.
SEQUENZANALYSE
VON
DNA
31
2.9.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
32
2.9.1.
5'-ENDMARKIERUNG
VON
DNA-RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
32
2.9.2.
"RANDOM
PRIMED"-DNA-MARKIERUNG
32
2.9.3.
ABTRENNUNG
NICHT
EINGEBAUTER,
RADIOAKTIVER
NUKLEOTIDE
32
2.9.4.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
33
2.10.
SOUTHERNBLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
33
2.11.
IN
VITRO
MUTAGENESE
33
2.12.
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
34
2.13.
KERNPROTEINEXTRAKTION
AUS
HEFEZELLEN
34
2.13.1.
PRAEPARATION
EINER
GROBEN
KERNFRAKTION
34
2.13.2.
PROTEINEXTRAKTION
AUS
EINER
GROBEN
KERNFRAKTION
35
2.14.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
35
2.15.
GELRETARDATIONSASSAY
36
2.16.
IN
VIVO
DNASEL
FOOTPRINTING
36
2.16.1.
ISOLIERUNG
VON
HEFEKERNEN
36
2.16.2.
SPALTUNG
VON
CHROMATIN
MIT
DNASEL
37
III.
ERGEBNISSE
38
1.
KONSTRUKTION
DER
PYLZ-VEKTOREN
39
2.
ERMITTLUNG
DES
MINIMAL
FUNKTIONSFAEHIGEN
PFY1-PROMOTERS
DURCH
SUKZESSIVE
VERKUERZUNG
DES
5'-FLANKIERENDEN
BEREICHS
44
2.1.
KONSTRUKTION
DER
PFY7//ACZ-KONSTRUKTE
45
2.2.
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAETEN
46
3.
MUTATIONSANALYSE
DES
PRAESUMPTIVEN
TATA-ELEMENTS
49
3.1.
MUTAGENESE
DES
PRAESUMPTIVEN
TATA-ELEMENTS
49
3.2.
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
DER
PFYMACZ-HYBRIDGENE
MIT
TATA-BOX
MUTATIONEN
50
4.
IDENTIFIZIERUNG
UND
ANALYSE
WEITERER
MOEGLICHER
CFS-WIRKSAMER
ELEMENTE
IM
PROMOTERBEREICH
DES
PFY1-GENS
53
4.1.
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
MIT
DEM
PROMOTERFRAGMENT
H0/R1:
PROTEINTITRATION,
UNSPEZIFISCHE
UND
HOMOLOGE
KOMPETITION
55
4.2.
GELRETARDATIONSEXPERIMENT:
HOMOLOGE
KOMPETITION
DER
PROTEINBINDUNG
AN
DAS
FRAGMENT
H0/R1
MIT
TEILFRAGMENTEN
AUS
DIESEM
BEREICH
56
5.
ANALYSE
DER
PRAESUMPTIVEN
DATIN-BINDUNGSSTELLE
58
6.
ANALYSE
DER
PRAESUMPTIVEN
GRF2P-BINDUNGSSTELLE
60
6.1.
NACHWEIS
DER
GRF2P-BINDUNG
AN
DAS
BINDEELEMENT
IM
PROFILINPROMOTER
61
6.1.1.
NACHWEIS
DER
GRF2P-BINDUNG
DURCH
HETEROLOGE
KOMPETITION
IM
GELRETARDATIONSEXPERIMENT
61
6.1.2.
NACHWEIS
DER
BINDUNG
EINES
REKOMBINANTENGRF2P
AN
DIE
BINDESTELLE
IM
PROFILINPROMOTER
64
6.1.3.
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
MIT
MUTIERTER
GRF2P-BINDESTELLE
67
6.1.3.1.
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
GRF2P-BINDESTELLE
67
6.1.3.2.
GELRETARDATIONSEXPERIMENT
MIT
DEM
MUTIERTEN
GRF2P-BINDUNGSMOTIV
68
6.2.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
GRF2P-BINDESTELLE
IM
PFYF-PROMOTER
70
7.
ANALYSE
DER
CHROMATINSTRUKTUR
DES
PROFILINPROMOTERS
72
7.1.
ANALYSE
DER
CHROMATINSTRUKTUR
DES
PPYPPROMOTERS
MIT
INTAKTER
GRF2P-BINDUNGSSTELLE
74
7.2.
ANALYSE
DER
CHROMATINSTRUKTUR
DES
PFY1-PROMOTERS
MIT
MUTIERTER
GRF2P-BINDESTELLE
78
7.2.1.
INSERTION
DER
MUTIERTEN
GRF2-BINDUNGSSTELLE
IN
DAS
HETEGENOM
78
7.2.1.1.
DISRUPTION
DES
LEOJ-LESERAHMENS
83
7.2.2.
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
GRF2P-BINDUNGSSTELLE
UND
INSERTION
INS
HETEGENOM
85
7.3.
VERGLEICHENDE
ANALYSE
DER
CHROMATINSTRUKTUR
DES
PFY1
PROMOTERS
IN
DEN
BEIDEN
STAEMMEN
W303
UND
HPLO/C15-T56
89
VI.
DISKUSSION
97
V.
ZUSAMMENFASSUNG
111
VI.
LITERATUR
114 |
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