Neutrophile Matrix-Metalloproteinasen: cDNA-Sequenzanalysen und Expression in Pro- und Eukaryonten
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
I ZUSAMMENFASSUNG. 1
II EINLEITUNG . 3
1 YY VORKOMMEN VON KOLLAGENASEN .
3
2. FUNKTIONEN VON KOLLAGENASEN IM KOERPER.
4
3. KLASSIFIZIERUNG DER MMP'S .
5
4. REGULATION DER EXPRESSION VON KOLLAGENASEGENEN . 10
5- AKTIVIERUNG DER LATENTEN MATRIXMETALLOPROTEINASEN 11
6. HEMMUNG DER KOLLAGENASEN DURCH TIMP . 12
7. EXPRESSIONSSYSTEME. 12
7.1. EXPRESSION IN PROKARYONTEN .
13
7.2. EXPRESSION IN EUKARYONTEN.
14
8. PROBLEMSTELLUNG.
15
III ERGEBNISSE . 16
1 YY ISOLIERUNG VON CDNA-KLONEN DER 92KDA GELATINASE (MMP-9) . 16
1.1 "SCREENING" EINER ^-GT11 CDNA-GENBANK AUS MENSCHLICHEN
LEUKOZYTEN .
17
1.2. TEILSEQUENZIERUNG DER IM "PLAQUE-BLOT" POSITIV REAGIERENDEN
KLONE . 18
1.3. AMPLIFIZIERUNG DER CDNA DER MMP-9 MIT HILFE DER RT-PCR-
TECHNIK.
19
1.4. SEQUENZIERUNG DER MMP-9-CDNA . . . 20
2. AMPLIFIZIERUNG VON CDNA-SEQUENZEN DER LEUKOZYTAEREN TYP I
KOLLAGENASE (MMP-8) . 26
2.1. RT-PCR VON ISOLIERTER RNA AUS LEUKAEMISCHEM KNOCHENMARK . . 26
2.2. KLONIERUNG VON CDNA'S, DIE FUER DIE LEUKOZYTAERE PRO-KOLLAGE-
NASE (PRO-MMP-8) KODIEREN . 28
2.2.1. KONSTRUKTION DES PLASMIDS PC2. 28
2.2.2. SEQUENZIERUNG UND DATENBANKVERGLEICH DER MMP-8-CDNA
DES PLASMIDS PC2. 29
2.2.3. KONSTRUKTION DE*S PLASMIDS PC3. 36
2.2.4. SEQUENZIERUNG UND DATENBANKVERGLEICH DES CDNA-"LNSERTS"
DES PLASMIDS PC3 . 36
2.2.5. SYNTHESE DES PLASMIDS PC4 AUS DEN PLASMIDEN PC2 UND PC3 . 39
2.2.6. SEQUENZIERUNG DES CDNA-"!NSERTS" DES PLASMIDS PC4. 39
3. EXPRESSION DER RPRO-MMP-8 IN E.COLI. 42
3.1. QUANTITATIVER UND QUALITATIVER NACHWEIS DES REKOMBINANTEN
ENZYMS. 44
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/941010171
3.2.
4.
4.1.
4.1.1.
4.1.1.1.
4.1.1.2.
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.2.3.
4.3.
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
OPTIMIERUNG DER EXPRESSION CFER RPRO-MMP-8 IN
COLI.
EXPRESSION DER REKOMBINANTEN NEUTROPHILEN PRAE-PRO-KOILAGE-
NASE (RPRAE-PRO-MMP-8) IM EUKARYONTISCHEN ZELLKULTURSYSTEM
(BHK21) .\
ISOLIERUNG DER CDNA DER PRAE-PRO-MMP-8.
STRATEGIE ZUR KLONIERUNG DER CDNA DER PRAE-PRO-MMP-8
ISOLIERUNG EINES 470BP FRAGMENTES AUS DEM 5' BEREICH DER
CDNA-SEQUENZ DER PRAE-PRO-MMP-8.
ISOLIERUNG EINES 3630BP GROSSEN DELETIONSDERIVATES DES PLAS
MIDS PC4 UND KONSTRUKTION DES PLASMIDS PC5 .
SEQUENZIERUNG DER CDNA DER-EN|-PRO-MMP-8.! ! ! . !
KLONIERUNG DER CDNA DER PRAE-PRO-MMP-8 IN DEN EUKARYONTI-
SEHEN EXPRESSIONSVEKTOR PMPSVHE.
TEILSEQUENZIERUNG DER PRAE-PRO-CDNA DER MMP-8 IN DEM PLAS
MID PC5M.
TRANSFEKTIONEN MIT DEM TRANSFEKTIONSREAGENZ LIPOFECTIN
YY
IDENTIFIZIERUNG VON RMMP-8-PRODUZENTEN MITTELS ELISA.
AMPLIFIZIERUNGSVERSUCHE ZUR STEIGERUNG DER EXPRESSION DER
RPRO-MMP-8 .
NACHWEIS DES REKOMBINANTEN ENZYMS.
TRANSFEKTIONEN MIT DOTAP-TRANSFEKTIONSREAGENZ
YY
IDENTIFIZIERUNG VON RMMP-8-PRODUZENTEN MITTELS ELISA.
AMPLIFIZIERUNGSVERSUCHE ZUR STEIGERUNG DER EXPRESSION DER
RPRO-RMMP-8 .
NACHWEIS DES REKOMBINANTEN ENZYMS.
45
49
49
49
52
52
53
54
56
57
60
61
65
69
73
74
74
IV DISKUSSION
78
1. IDENTIFIZIERUNG VON MMP-9-SPEZIFISCHEN CDNA-SEQUENZEN
2. IDENTIFIZIERUNG VON MMP-8-SPEZIFISCHEN CDNA-SEQUENZEN
3. EXPRESSION DER RPRO-MMP-8 IN . COLI.
4. EXPRESSION DER RPRO-MMP-8 IN BHK21-ZELLEN
5. AUSBLICK.
78
80
89
90
93
V METHODEN
95
I GENTECHNO
LOGISCHE
METHODEN.
1 YY KULTIVIERUNG VON BAKTERIENSTAEMMEN.
V 1 YY 1 YY ANZUCHT VON
E. COLI.
2- CACI2-TRANSFORMATION VON E. COLI.
2.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN."
2.2. TRANSFORMATION.
3. METHODEN ZUR ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS . COLI
3.1. SCHNELL-LYSE .
3.2. HB-LYSE .
3.3. SEQUENZIERLYSE (QUIAGEN-LYSE).
95
95
95
95
95
96
96
96
97
97
II
3.4. PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG DURCH GELFILTRATION . 98
4. REINIGUNG VON DNA. 99
4.1. ETHANOLFAELLUNG VON DNA . 99
4.2. SEPHADEX-G50-SAEULENCHROMATOGRAPHIE. 100
5. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN. 100
5.1. DAS "GENECLEAN" VERFAHREN. 100
5.2. DAS GLASWATTEVERFAHREN . 101
6. CHARAKTERISIERUNG DER DNA. 101
6.1. RESTRIKTIONSSPALTUNG . 101
6.2. PARTIELLE RESTRIKTIONSSPALTUNG IN GEGENWART VON ETBR. 101
6.3. AGAROSEGELELEKTROPHORESE UND AUSWERTUNG DER GELE. 102
6.4. DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG. 103
7. KLONIERUNGSEXPERIMENTE. 104
7.1. ALKALISCHE PHOSPHATASE-BEHANDLUNG VON DNA . 104
7.2. DELETIONSBILDUNG MIT EXONUKLEASE ILL/S1-NUKLEASE-BEHANDLUNG
("DOUBLE STRANDED NESTED DELETION KIT", PHARMACIA). 104
7.3. LIGATION MIT T4-LIGASE. 105
8. SCREENING EINER ^GT11 CDNA-GENBANK. 105
8.1. HERSTELLEN EINER BAKTERIENSUSPENSION. 105
8.2. INFEKTION. 106
9. HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE. 106
9.1. PLAQUE-BLOT . 106
9.2. SOUTHERN-BLOT. 106
9.3. MARKIERUNG DER HYBRIDISIERUNGSSONDE MIT DIGOXYGENIN-DUTP . 107
9.3.1. "TAILING VON OLIGOS" . 107
9.3.2. "RANDOM PRIMING" . 107
9.4. HYBRIDISIERUNG . . 107
9.5. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DER HYBRIDISIERENDEN DNA. 108
10. DNA-SEQUENZIERTECHNIKEN . 108
10.1. DNA-SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA NACH SAENGER. 108
10.1.1. DENATURIERUNG DER PLASMID-DNA . 109
10.1.2. HYBRIDISIERUNG DES OLIGONUKLEOTID-PRIMERS ("ANNEALING" REAK
TION) . 109
10.1.3. MARKIERUNGSREAKTION ("LABELING" REAKTION). 109
10.1.4. TERMINATIONSREAKTION. 110
10.2. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE . 110
10.2.1. HERSTELLUNG EINES POLYACRYLAMIDGELS. 110
10.2.2. GIESSEN DES POLYACRYLAMIDGELS. 110
10.2.3. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE . 111
10.2.4. FIXIERUNG DES. POLYACRYLAMIDGELS UND AUTORADIOGRAPHIE. 111
10.3. NICHTRADIOAKTIVE PLASMID-DNA-SEQUENZIERUNG MIT DEM
A.L.F. 111
10.3.1. ANNEALING DES FLUORESZENZMARKIERTEN PRIMERS . 112
10.3.2. DURCHFUEHRUNG DER SEQUENZIERREAKTIONEN . 112
10.3.3. VORBEREITUNG DES SEQUENZIERGELS . 113
10.3.4. AUFBAU DES A.L.F. UND LADEN DES SEQUENZIERGELS. 114
10.3.5. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE DER SEQUENZIERUNG. 114
11. ASYMMETRISCHE PCR FUER DIE DIREKTE SEQUENZIERUNG . 114
III
12. COMPUTERGESTUETZTE DNA- UND PROTEIN-SEQUENZANALYSE. 115
13. POLYMERASEKETTENREAKTION . 115
N
PROTEINCHEMISCHE METHODEN. 116
14. 'ENZYME LINKED IMMUNOADSORBENT ASSAY' (ELISA) . 116
15. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE) FUER PROTEINGELE . 117
15.1. COOMASSIE-BRILLIANT-BLUE FAERBUNG VON PROTEINGELEN . 118
15.2. SILBERFAERBUNG VON PROTEINGELEN . 118
16. WESTERNBLOT . 119
16.1. TRANSFER DER PROTEINE DURCH ELEKTROBLOT . 119
16.2. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS IMMOBILISIERTER PROTEINE. 119
17. INDUKTION UND EXPRESSION DES PROKARYONTISCHEN EXPRESSIONS
SYSTEMS . 120
18. PROTEINISOLIERUNG AUS ECO/F-EINSCHLUSSKOERPEM .120
19. AKTIVITAETSTEST DURCH KOLLAGENSPALTUNG .121
UI
ZELLKULTUR. 121
20. KULTIVIERUNG VON BHK21-ZELLEN.122
20.1. ANZUCHT UND HALTUNG VON BHK21-ZELLEN.122
20.2. LANGZEITLAGERUNG VON BHK21-ZELLEN.123
21. TRANSFEKTIONEN.123
21.1. "LIPOFECTION" .124
21.2. TRANSFEKTION MIT DOTAP-TRANSFEKTIONSREAGENZ.125
22. SELEKTION. 125
23. AMPLIFIKATION .126
24. KLONIERUNG RESISTENTER KOLONIEN.126
*
VI MATERIAL. 127
VII LITERATUR. 137
VIII ABKUERZUNGEN .149
IV |
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| title_full_unstemmed | Neutrophile Matrix-Metalloproteinasen cDNA-Sequenzanalysen und Expression in Pro- und Eukaryonten vorgelegt von Andreas Hillemann |
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| title_sort | neutrophile matrix metalloproteinasen cdna sequenzanalysen und expression in pro und eukaryonten |
| title_sub | cDNA-Sequenzanalysen und Expression in Pro- und Eukaryonten |
| topic | DNS-Sequenz (DE-588)4150352-1 gnd cDNS (DE-588)4212297-1 gnd Genexpression (DE-588)4020136-3 gnd Kollagenasen (DE-588)4164653-8 gnd |
| topic_facet | DNS-Sequenz cDNS Genexpression Kollagenasen Hochschulschrift |
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| work_keys_str_mv | AT hillemannandreas neutrophilematrixmetalloproteinasencdnasequenzanalysenundexpressioninproundeukaryonten |