Expression und Funktion von Fibronektin-Isoformen in der Embryonalentwicklung und Morphogenese von Xenopus laevis:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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1.
EINLEITUNG
1
1.1.
INDUKTIONSEREIGNISSE
IM
AMPHIBIENEMBRYO
1
1.2.
MECHANISMEN
DER
ZELLADHAESION
2
1.3.
ZELL-ZELLADHAESION
4
1.4.
ZELL-SUBSTRATADHAESION
5
1.4.1.
MOLEKUELE
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX
5
I.4.I.I.
FIBRONEKTIN
6
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DES
FIBRONEKTINS
8
REGULATION
DER
FN-SYNTHESE
9
I.4.I.2.
LAMININ
9
1.4.2.
INTEGRINE
11
I.4.2.I.
FUNKTIONEN
DER
INTEGRINE
12
1.5.
FIBRONEKTIN/INTEGRIN-INTERAKTIONEN
IN
DER
FRUEHEN
EMBRYONALENTWICKLUNG
14
1.5.1.
WANDERUNG
DER
NEURALLEISTENZELLEN
14
1.5.2.
WANDERUNG
DER
PRAESUMPTIVEN
KEIMZELLEN
15
1.5.3.
GASTRULATION
15
1.6.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
17
2.
MATERIALIEN
18
3.
METHODEN
22
3.1.
PROTEINBIOCHEMIE
ALLGEMEINE
METHODEN
22
3.1.1.
VORKEHRUNGEN
GEGEN
PROTEOLYTISCHEN
ABBAU
25
3.1.2.
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
25
3.1.3.
METHODEN
ZUR
PROTEINBESTIMMUNG
26
3.1.4.
DIALYSE
VON
PROTEINLOESUNGEN
27
3.1.5.
ANREICHERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
27
3.1.6.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
MITTELS
SDS-PAGE
27
3.1.7.
FAERBEMETHODEN
FUER
POLYACRYLAMIDGELE
28
3.1.8.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
29
3.1.9.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
VON
PROTEINEN
30
HERSTELLEN
EINER
AFFINITAETSSAEULE
30
ISOLIERUNG
VON
PLASMAFIBRONEKTIN
AUS
SEREN
30
3.1.10.
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
OOCYTEN
UND
EMBRYONEN
31
EXTRAKTION
VON
FIBRONEKTIN
31
SOLUBILISIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
32
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
ADULT-ORGANEN
32
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
KULTURZELLEN
33
3.1.11.
TRYPTISCHE
SPALTUNG
VON
PLASMAFIBRONEKTIN
33
3.1.12.
ANREICHERUNG
VON
GLYKOPROTEINEN
AN
CONA-SEPHAROSE
33
3.1.13.
BIOTINYLIERUNG
VON
ZELLOBERFLAECHEN
34
OBERFLAECHENMARKIERUNG
VON
KULTURZELLEN
34
OBERFLAECHENMARKIERUNG
EMBRYONALER
ZELLEN
35
3.1.14.
ANREICHERUNG
UND
REINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
35
IMMUNCHEMISCHE
METHODEN
37
3.1.15.
WESTEM-BLOTTING
IM
TANKVERFAHREN
39
3.1.16.
DETEKTIONSMETHODEN
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
40
NACHWEIS
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
40
BFACHWEIS
MIT
PEROXIDASE
40
BIOTINNACHWEIS
MITTELS
STREPTAVIDIN-GEKOPPELTEN
ENZYMEN
41
3.1.17.
METHODEN
DER
IMMUNPRAEZIPITATION
41
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
PROTEIN
G-SEPHAROSE
41
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
PROTEIN
A-SEPHAROSE
42
3.1.18.
ELISA
43
3.1.19.
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
44
AUFREINIGUNG
AN
EINER
AFFINITAETSSAEULE
44
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
AN
NITROZELLULOSE
44
3.1.20.
AUFREINIGUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
AUS
KULTURUEBERSTAENDEN
45
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
AN
HYDROXYLAPATIT
45
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
AN
AFFITYY
45
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
MITTELS
PROTEIN
G
SEPHAROSE
46
3.1.21.
SUBTYPENBESTIMMUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
46
3.1.22.
HERSTELLUNG
VON
FAB-FRAGMENTEN
46
3.1.23.
LAGERUNG
VON
ANTIKOERPERLOESUNGEN
47
3.2.
ARBEITEN
MIT
EUKARYONTISCHEN,
PERMANENTEN
ZELLINIEN
47
3.2.1.
ANSETZEN
UND
STERILFILTRATION
VON
DMEM-MEDIUM
49
3.2.2.
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
49
3.2.3.
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
49
3.2.4.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
50
3.2.5.
BEHANDLUNG
VON
PILZ
BZW.
BAKTERIEN-KONTAMINATIONEN
IN
DER
ZELLKULTUR
50
3.2.6.
HERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
50
3.2.6.I.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
51
3.2.6.2.
BLUTENTNAHME
AUS
DER
SCHWANZVENE
51
3.2.6.3.
ZELLFUSION
UND
ANSCHLIESSENDE
HAT-SELEKTION
51
3.2.6.4.
SUBKLONIERUNG
VON
HYBRIDOMKLONEN
("LIMITED
DILUTION")
52
3.2.6.5.
KULTIVIERUNG
DER
HYBRIDOM-KLONE
IN
SERUMFREIEN
MEDIUM
52
3.2.7.
PRAEPARATION
VON
PERITONEAL-MAKROPHAGEN
53
3.2.8.
ZELLADHAESIONS
BZW.
-INHIBITIONSTESTS
53
BESCHICHTUNG
VON
GLAS
UND
PLASTIKWARE
MIT
PROTEIN
54
ADHAESIONSTEST
MIT
XENOPUS-ZELLINIEN
54
INHIBITION
DER
ADHAESION
MIT
ANTIKOERPERN
54
INHIBITION
DER
ADHAESION
MIT
PEPTIDEN
54
ADHAESIONSTEST
AN
SOMITENZELLEN
55
3.2.9.
AUSPLATTIEREN
VON
KULTURZELLEN
FUER
DIE
IMMUNHISTOLOGIE
56
3.3.
HISTOLOGIE
56
3.3.1.
FIXIERUNG
VON
EMBRYONEN
57
3.3.2.
EINBETTUNGEN
58
3.3.3.
IMMUNHISTOLOGIE
59
3.3.3
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
MITTELS
FITC-KONJUGIERTEN
ANTIKOERPERN
59
3.3.3.2.
IMMUNFAERBUNG
AN
GANZEN
EMBRYONEN
("WHOLE
MOUNT"
VERFAHREN)
60
3.3.3.3.
IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE
61
3.4.
ARBEITEN
MIT
XENOPUS
LAEVIS-EMBRYONEN
62
3.4.1.
AUFZUCHT
63
3.4.2.
OOCYTENPRAEPARATION
63
3.4.3.
OOCYTENREIFUNG
64
3.4.4.
OPERATIONEN
AM
EMBRYO
64
PRAEPARATION
ANIMALER
UND
VEGETALER
HAELFTEN
64
PRAEPARATION
VON
SOMITEN
3.4.5.
3.4.6.
3.4.7.
3.4.8.
DISSOZIATION
EMBRYONALER
ZELLEXPLANTATE
REAGGREGATIONSEXPERIMENTE
HITZESCHOCKEXPERIMENTE
AN
EMBRYONEN
MIKROINJEKTION
IN
EMBRYONEN
8
2
2
8
8
S
SS
S
J
IM
3
$
85
85
5
8
8
8
8
4.
ERGEBNISSE
4.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMAFIBRONEKTIN
4.2.
UNTERSUCHUNG
DES
XENOPUS-FIBRONEKTINS
MIT
HILFE
EINES
HETEROLOGEN
FIBRONEKTIN
ANTIKOERPERS
4.3.
OPTIMIERUNG
VON
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
4.3.1.
DARSTELLUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER,
DIE
GEGEN
X.
LAEVIS
PLASMAFIBRONEKTIN
ERHALTEN
WURDEN
4.3.2.
EINGEHENDERE
CHARAKTERISIERUNG
DES
MAK
6D9
4.3.3.
EXTRAKTION
VON
FIBRONEKTIN
AUS
FROSCHGEWEBE
4.3.4.
VERBESSERUNG
DER
TRANSFERS
VON
SCHWERLOESLICHEN
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
4.4.
EXPRESSIONSMUSTER
VON
FIBRONEKTIN
IN
DER
EMBRYOGENESE
VON
XENOPUS
LAEVIS
4.4.1.
DIE
FRUEHE
EMBRYONALENTWICKLUNG
DES
SUEDAFRIKANISCHEN
KRALLENFROSCHES
XENOPUS
LAEVIS
DIE
OOGENESE
VOM
BEFRUCHTETEN
EI
ZUR
GASTRULA
DIE
SOMITOGENESE
BEI
XENOPUS
4.4.2.
WESTERN-BLOT
ANALYSE
VON
V
+
-FIBRONEKTIN
IN
DER
FRUEHEN
ENTWICKLUNG
4.4.3.
INDUKTION
DER
FN-EXPRESSION
MIT
OOCYTENREIFUNG
4.4.4.
LOKALISATION
DES
VOR
MBT
EXPRIMIERTEN
FIBRONEKTINS
89
4.4.5.
FEINLOKALISATION
DES
PRAEGASTRULAEREN
FIBRONEKTINS
90
4.4.6.
IDENTIFIZIERUNG
VON
FIBRONEKTIN-REZEPTOREN
IN
DER
FRUEHEN
EMBRYONALENTWICKLUNG
93
4.5.
EXPRESSION
VON
V
+
-FIBRONEKTIN
WAEHREND
DER
MORPHOGENESE
95
4.6.
EXPRESSION
VON
FIBRONEKTIN
IN
ADULTORGANEN
97
4.7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUNKTION
BZW.
FUNKTIONELLER
DOMAENEN
DES
FIBRONEKTINS
100
4.7.1.
UNTERSUCHUNG
DER
FUNKTION
DES
V+-FBRONEKTINS
VOR
UND
WAEHREND
DER
GASTRULATION
100
REAGGREGATIONSEXPERIMENTE
AN
XENOPUS-BLASTOMEREN
100
MIKROINJEKTION
DES
MAK
6D9
IN
EMBRYONEN
102
4.7.2.
UNTERSUCHUNG
DER
ROLLE
DES
FIBRONEKTINS
IN
DER
SOMITEN
BILDUNG
103
HITZESCHOCKEXPERIMENTE
WAEHREND
DER
SOMITOGENESE
103
FIBRONEKTIN-ABHAENGIGE
ADHAESION
VON
SOMITENZELLEN
108
4.8.
EXPRESSION
VON
FIBRONEKTIN
IN
KULTURZELLEN
110
4.8.1.
ADHAESIONSVERHALTEN
DER
XENOPUS-KULTURZELLEN
111
4.8.2.
WELCHE
BEREICHE
DES
FIBRONEKTINS
SIND
FUER
ZELLSPREITUNG
VERANTWORTLICH?
115
4.8.3.
INTEGRINEXPRESSION
DER
KULTURZELLEN
117
5.
DISKUSSION
120
5.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMAFIBRONEKTIN
AUS
SEREN
120
5.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
121
5.3.
FIBRONEKTIN
IN
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
122
5.3.1.
FEXPRESSION
DES
V-SEGMENTES
WAEHREND
DER
EMBRYONAL
ENTWICKLUNG
125
5.4.
NACHWEIS
VON
FIBRONEKTINREZEPTOREN
IN
DER
ENTWICKLUNG
MITTELS
HETEROLOGER
ANTIKOERPER
126
5.5.
FIBRONEKTINEXPRESSION
IN
DER
MORPHOGENESE
127
5.5.1.
DIE
ROLLE
DES
FIBRONEKTINS
IN
DER
SOMITOGENESE
128
5.6.
EXPRESSION
VON
FIBRONEKTIN
IN
ADULTGEWEBE
UND
XENOPUS
ZELLINIEN
130
5.7.
EINFLUSS
DES
FIBRONEKTINS
AUF
DIE
ADHAESION
VON
FIBROBLASTEN,
A6
UND
XTC-ZELLEN
131
6.
ZUSAMMENFASSUNG
135
7.
LITERATUR
138 |
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