Entwicklung zellulärer Vektorsysteme für den Gentransfer: Expression neurotropher Faktoren in genetisch veränderten T-Zellen
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1.
EINLEITUNG
.
7
2.
ABKUERZUNGEN
.
14
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
16
3.1.
MATERIAL
.
16
3.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
16
3.1.2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
17
3.1.3.
GERAETE
.
17
3.1.4.
PUFFERLOESUNGEN
.
17
3.1.5.
ENZYME,
BAKTERIEN,
PLASMIDVEKTOREN
UND
NUKLEINSAEUREN
.
18
3.1.6.
ZELLEN
.
18
3.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
18
3.2.1.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
DURCH
ELEKTROPORATION
.
18
3.2.1.1.
VORBEREITUNG
DER
BAKTERIEN
.
18
3.2.1.2.
ELEKTROPORATION
.
19
3.2.2.
PLASMIDPRAEPARATION
.
19
3.2.2.1
ALKALISCHE
LYSE
.
19
3.2.2.2.
REINIGUNG
UEBER
QIAGENSAEULEN
.
20
3.2.2.3.
REINIGUNG
UEBER
EINEN
CAESIUMCHLORIDGRADIENTEN
.
21
3.2.3.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
22
3.2.4.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ALKOHOLISCHE
FAELLUNG
.
23
3.2.5.
AGAROSEGELE
.
23
3.2.6.
REINIGUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
24
3.2.7.
IN
VITRO
RNA-TRANSKRIPTION
.
24
3.2.8.
RADIOAKTIV
MARKIEREN
VON
CDNA
.
25
3.2.9.
GENOMISCHE
SOUTHERNBLOT
ANALYSE
.
25
3.2.10.
NORTHERNBLOT
ANALYSE
.
26
3.2.11.
RNA
GELELEKTROPHORESE
.
27
3.2.12.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
NYLONMEMBRANEN
.
27
3.2.13.
HYBRIDISIERUNG
DER
TRANSFERIERTEN
NUKLEINSAEUREN
.
28
3.2.14.
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
.
29
3.2.14.1.
KALZIUMPHOSPHAT-SEDIMENTATIONS-METHODE
.
29
3.2.14.2.
ELEKTROPORATIONSMETHODEN
.
29
3.2.14.3.
LIPOFEKTION
.
30
3.2.15.
CHLORAMPHENICOL
-
AZETYLTRANSFERASE
TEST
.
30
3.2.16.
HERSTELLUNG
DES
NGF-RETROVIRUS
UND
VIRALE
TRANSDUKTION
.
32
3.2.17.
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
.
32
3.3.
ZELLKULTUR
.
33
3.3.1.
SEKUNDAERKULTUREN
.
34
3.3.2.
ANTIGENSTIMULATION
UND
PROLIFERATIONSTEST
.
34
3.3.3.
ANTIGENE
.
34
3.3.4.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
.
35
3.4.
NGF-ELISA
.
35
3.5.
NGF-BIOASSAY
.
35
3.6.
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
36
4.
ERGEBNISSE
.
38
4.1.
CHEMISCHE
UND
PHYSIKALISCHE
TRANSFEKTIONVERSUCHE
.
38
4.1.1.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
.
39
4.1.1.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
CMVLAC
.
39
4.1.1.2.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
CMVCAT
.
40
4.1.2.
STABILE
TRANSFEKTION
.
42
4.2.
FUSION
VON
BW-F11
MITZ85
ZELLEN
.
44
4.2.1.
ANTIGENSTIMULATION
DER
T-ZELLHYBRIDE
.
45
4.2.2.
MEMBRANPHAENOTYP
DER
T-ZELLHYBRIDE
.
45
4.2.3.
PCR
ANALYSE
DER
T-ZELLHYBRIDE
.
46
4.2.4.
GENOMISCHER
SOUTHERNBLOT
DER
T-ZELLHYBRIDE
.
48
4.2.5.
NGF-EXPRESSION
DER
T-ZELLHYBRIDE
.
49
4.3.
RETROVIRALE
TRANSDUKTION
.
50
4.3.1.
NGF-RETROVIRUS
.
50
4.3
2.
TRANSDUKTION
VON
Z85
ZELLEN
.
51
4.3.3.
NGF-EXPRESSION
TRANSDUZIERTER
Z85
ZELLEN
.
53
4.3.4.
MEMBRANPHAENOTYP
TRANSDUZIERTER
Z85
ZELLEN
.
55
4.3.5.
IN
VIVO
EXPERIMENTE
MIT
TRANSDUZIERTEN
Z85
ZELLEN
.
56
4.3.6.
IN
VIVO
EXPERIMENTE
MIT
TRANSDUZIERTEN
P2
ZELLEN
.
57
5.
DISKUSSION
.
60
6.
LITERATUR
.
72
7.
ZUSAMMENFASSUNG
.
80 |
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