Entwicklung eines rekombinanten DNA-Systems für die Überexpression und Mutagenese der lichtgetriebenen Anionenpumpe Halorhodopsin von Halobakterien:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1993
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I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
5
2.1
TRANSPORT
ALS
GRUNDPROZESS
DES
LEBENS
5
2.2
AKTIVER
LONENTRANSPORT
5
2.3
LICHTENERGIEWANDLUNG
6
2.4
HALOBAKTERIEN
7
2.5
HALORHODOPSIN
9
2.6
STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG
11
2.7
HOMOLOGE
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
14
2.8
PROBLEMSTELLUNG
16
3.
ERGEBNISSE
17
3.1
KLONIERUNG
DES
HALO-OPSIN
GENS
17
3.2
GEZIELTE
MUTAGENESE
DES
HALORHODOPSINS
18
VEKTOREN
FUER
DIE
MUTAGENESE
18
PCR-VERMITTELTE
MUTAGENESE
20
MUTAGENESE
NACH
KUNKEL
21
3.3
EXPRESSIONSSYSTEME
FUER
E.COLI
UND
S.POMBE
24
VEKTOREN
FUER
E.COLI
24
EXPRESSION
IN
E.COLI
25
II
VEKTOREN
FUER
S.POMBE
27
EXPRESSION
IN
S.POMBE
28
3.4
TRANSFORMATION
VON
HALOBAKTERIEN
29
VEKTOREN
FUER
H.VOLCANII
29
TRANSFORMATION
VON
H.VOLCANII
29
VEKTOREN
FUER
H.SALINARIUM
30
TRANSFORMATION
VON
H.SALINARIUM
30
3.5
UEBEREXPRESSION
VON
HALORHODOPSIN
IN
HALOBACTERIUM
SALINARIUM
31
EXPRESSION
VON
HR
DURCH
GENFUSION
31
EXPRESSION
VON
HR
DURCH
HOP-PROMOTER
36
TRANSFORMATION
UND
EXPRESSION
IN
H.SALINARIUM
36
3.6
GENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRANSFORMANDEN
38
3.7
PHYSIOLOGIE
TRANSFORMIERTER
STAEMME
40
WACHSTUMSVERHALTEN
VON
TRANSFORMANDEN
40
HR-AKTIVITAET
IN
ZELLEN
42
MORPHOLOGIE
UND
MOTILITAET
43
PHO81-HR:
EIN
BR,SRI
UND
SRII-NEGATIVER
HR-UEBERPRODUZENT
43
3.8
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTEN
HALORHODOPSINS
44
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
44
PROTEINGEWINNUNG
45
STABILITAET
VON
REKOMBINANTEM
HR
47
MIKROSEQUENZIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
HR
47
III
HALORHODOPSINCHROMOPHOR
49
BESTIMMUNG
DES
PK-WERTES
DER
SCHIFFSCHEN
BASE
50
BLITZLICHTPHOTOLYSE
53
3.9
EXPRESSION
MUTIERTEN
HALORHODOPSINS
57
VEKTOREN
FUER
DIE
EXPRESSION
VON
MUTIERTEM
HR
57
TRANSFORMATION
UND
EXPRESSION
DER
HR-MUTANTEN
58
REKOMBINANTES
PROTEIN
60
SPEKTROSKOPIE
62
LONENTRANSPORT
66
3.10
KRISTALLINES
HALORHODOPSIN
66
4.
DISKUSSION
69
4.1
HOMOLOGE
VERSUS
HETEROLOGE
EXPRESSION
69
HOMOLOGE
EXPRESSION
VON
HALORHODOPSIN
69
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
HALORHODOPSIN
74
4.3
REKOMBINANTES
HALORHODOPSIN
76
4.4
GERICHTETE
MUTAGENESE
VON
HALORHODOPSIN
83
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
90
5.1
MATERIALIEN
90
GERAETE
90
IV
CHEMIKALIEN
90
ENZYME
91
REKOMBINANTE
DNA
92
WIRTSYSTEME
93
5.2
.
UMGANG
MIT
WIRTSYSTEMEN
94
MEDIEN
FUER
ZELLKULTUREN
94
KULTIVIERUNG
97
ERNTE
98
AUFBEWAHRUNG
98
WACHSTUMSKINETIK
99
5.3
GENETISCHE
VERFAHREN
99
TRANSFORMATION
99
TRANSFEKTION
101
5.4
VERFAHREN
IM
UMGANG
MIT
DNA
101
PUFFER
UND
LOESUNGEN
101
EXTRAKTION
UND
FAELLEN
103
GEWINNUNG
VON
DNA
103
REINIGUNG
107
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
108
UMSETZUNG
MIT
ENZYMEN
109
MUTAGENESE
NACH
KUNKEL
111
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
112
ANALYSE
VON
DNA
113
AUFBRINGEN
VON
DNA
AUF
KUNSTSTOFF-MEMBRANEN
115
V
HYBRIDISIERUNG
FITERGEBUNDENER
DNA
116
AUTORADIOGRAPHIE
117
5.5
VERFAHREN
IM
UMGANG
MIT
PROTEINEN
117
PUFFER
UND
LOESUNGEN
117
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
118
GEWINNUNG
VON
PROTEIN
118
HR-MEMBRANFRAKTIONEN
119
HANDHABUNG
VON
MEMBRANEN
120
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
120
AUFBRINGEN
VON
PROTEIN
AUF
KUNSTSTOFF-MEMBRANEN
121
HYBRIDISIERUNG
MIT
ANTIKOERPERN
121
RETINALEXTRAKTION
122
HPLC-ANALYSE
DER
RETINALE
123
CHLORIDIONEN-PUMPAKTIVITAET
VON
HALORHODOPSIN
123
5.6
SPEKTROSKOPISCHE
VERFAHREN
124
BESTIMMUNG
DES
PK-WERTES
DER
SCHIFFSCHEN
BASE
124
BLITZLICHT-SPEKTROSKOPIE
124
6.
LITERATUR
125
7.
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
137 |
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