Entwicklung einer Methode zur Anreicherung von Hybriden nach somatischer Hybridisierung bei der Kartoffel (S. tuberosum L.) und einigen Wildarten:
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Abkürzungen
1.0 Einleitung 1
2.0 Material und Methoden 14
2.1. Pflanzenmaterial 14
2.2 Gewebekultur 15
2.2.1 Zur Gewebekultur verwendete Medien und Lösungen 15
2.2.2 Selektion auf Kanamycinresistenz 18
2.2.3 Anzucht und Erhaltung der Sproßkulturen 18
2.2.4 Kultur auf STS Medium 19
2.2.5 Protoplastenisolierung —19
2.2.6 Lectinmarkierung 21
2.2.7 Elektrofusion —21
2.2.8 Magnetische Separierung von Protoplasten 23
2.2.9 Regeneration von Pflanzen 24
2.3 Cytologische Methoden 25
2.4 Molekularbiologische Methoden 27
2.4.1 Pufferund Stammlösungen 27
2.4.2 DNA Isolierung 29
2.4.3 Restriktionsverdau der genomischen DNA 30
2.4.4 Gel Elektrophorese 31
2.4.5 Transfer auf Nylonmembranen — 31
2.4.6 Hybridisierung der Membranen 31
2.4.7 Detektion von [GATA]4 32
2.5 NPT II Test — — 34
3.0 Ergebnisse 35
3.1 Optimierung der Protoplastenisolierung— — 35
3.1.2 Ermittlung der Regenerationsrate 37
3.2 Lectinmarkierung von Protoplasten 38
3.2.1 Auswahl der Lectine 38
3.2.2 Abhängigkeit der Lectinmarkierung von der
Lectinkonzentration— 42
3.2.3 Abhängigkeit der Lectinmarkierbarkeit von der
Dauer der Inkubation in der Enzymlösung 43
3.2.4 Ermittlung der zur Markierung einiger Wildarten
geeigneten Lectine 46
3.3 MACS Optimierung der Separationsbedingungen 47
3.3.1 Einfluß der Elutionsgeschwindigkeit 47
3.3.2 Einfluß des Elutionsmittels 50
3.3.3 Bestimmung der unspezifischen Adhäsion der
Magnetpartikel 51
3.3.4 Qualität der magnetischen Auftrennung 53
3.3.5 Einfluß der magnetischen Separierung auf die
Kallusentwicklung 56
3.4 Selektion auf Kanamycinresistenz 57
35 Analyse somatischer Hybridisierungsexperimente 59
3.5.1 Einfluß d. Lectinmarkierung auf d. Fusionsrate 61
3.5.2 Anreicherung von Hybriden in der magnetischen
Fraktion. 63
3.5.3 Abhängigkeit des Hybridcharakters von der
Regenerationsdauer 66
3.6 Charakterisierung der Hybride 68
3.6.1 Aktivität der Neomycinphosphotransferase II 68
3.6.2 Phänotypische Charakterisierung der
intraspezifischen Hybriden 69
3.6.3 Cytologische Analyse der intraspezifischen
3.6.4 Phänotypische Charakterisierung der inter¬
spezifischen Hybriden 74
3.6.5 Cytologische Analyse der interspezifischen
Hybriden 79
4.0 Diskussion 81
5,0 Zusammenfassung 96
6.0 Literatur 98
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