Phosphatidylinositol-Kinase (EC 2.7.1.67) aus der einzelligen Grünalge Dunaliella parva:
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- 33 S
PHOSPHATIDYLINOSITOL-KINASE (EC 2.7.1.67) AUS DER EINZELLIGEN GRUENALGE
DUNALJELLA PARVA
VON DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET
DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET CAROLO-WIIHELMINA
ZU BRAUNSCHWEIG
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
(DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
D I S S E R T A T I ON
VON PETER STEINEN
AUS BERLIN
IMAGE 2
INHALT
INHALT
SEITE
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 6
2.1 ISOLIERUNG DER ALGE DUNALIELLA PARVA 6
2.2 HERSTELLUNG KONTINUIERLICH WACHSENDER ALGENKULTUREN 7 2.3
PIGMENTEXTRAKTION UND DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE AUFTRENNUNG 10 2.4
PROTEINASSAYS 11
2.5 EXTRAKTION UND DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE TRENNSYSTEME FUER
PHOSPHOLIPIDE 12
2.5.1 SAURES LAUFMITTEL NACH SHAIK & PALMER 13
2.5.2 PYRIDIN-TRENNSYSTEM NACH HAUSER & EICHBERG 13 2.5.3 BORAT-SYSTEM
NACH WALSH ET AL. 13
2.5.4 VISUALISIERUNG DER PHOSPHOLIPIDE . 14
2.6 UMSETZUNGEN VON PHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHAT 15
2.6.1 DERIVATISIERUNG ZU PHOSPHATIDYLINOSITOL-A-^PLPHOSPHAT 15 2.6.2
DEACYLIERUNG UND DEGLYCERIERUNG VON PHOSPHATIDYLINOSITOL- PPJPHOSPHAT 16
2.7 TRENNUNG VON INOSITOLPHOSPHATEN MITTELS HPLC 18
2.8 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 19
2.8.1 LEF-GELELEKTROPHORESE 19
2.8.2 VISUALISIERUNG DER PROTEINE 22
2.9 ANREICHERUNG VON ZEIL- UND MEMBRANFRAKTIONEN 23
2.9.1 HERSTELLUNG EINES ZELLFREIEN EXTRAKTES 23
2.9.2 ZELLFRAKTIONIERUNG 24
2.9.3 PLASMAMEMBRAN 24
2.10 IDENTITAETSBESTIMMUNG VON ZELLORGANELLEN UND MEMBRANFRAKTIONEN 27
2.10.1 ATPASE ALS MARKER FUER DIE PLASMAMEMBRAN 27 2.10.2 CYTOCHROM
C-REDUKTASE ALS MARKER FUER MEMBRANEN DES ER UND DIE KERNHUELLMEMBRAN 29
2.10.3 CYTOCHROM C-OXIDASE ALS MARKER FUER DIE MITOCHONDRIEN- MEMBRAN 30
2.11 SAEULENCHROMATOGRAPHIE (FPLC) 31
2.11.1 GELFILTRATION 31
2.11.2 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE 32
2.11.3 HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE 32 2.11.4
GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 33
2.11.5 CHROMATOFOKUSSIERUNG 34
2.12 DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 37
IMAGE 3
INHALT
2.12.1 GLYCERINGRADIENT
2.12.2 PERCOLL-GRADIENT 2.13 LOKALISIERUNG DER PL-KINASE 2.14 TESTS AUF
AKTIVITAET VON ENZYMEN DES INOSITOL-PHOSPHOLIPID- STOFFWECHSELS
2.14.1 PL-KINASE 2.14.2 PIP-KINASE 2.14.3 DAG-KINASE 2.14.4 TEST AUF
PIP-SPEZIFISCHE PHOSPHOMONOESTERASE UND PIP-
SPEZIFISCHE PHOSPHOLIPASEN 2.15 BESTIMMUNG ENZYMKINETISCHER KONSTANTEN
2.16 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 2.16.1 FIXIERUNG
2.16.2 KONTRASTIERUNG 2.16.3 ENTWAESSERUNG 2.16.4 EINBETTUNG 2.16.5
UTTRAMIKROTOMIE 2.16.6 SCHNITTKONTRAST
37 38 39
40 40 41 42
43 45 46 46 47 47 47 48 48
3 ERGEBNISSE 49
3.1 DIE ALGE DUNALIELLA PARVA 49
3.2 KULTIVIERUNG DER ALGE DUNALIELLA PARVA 52
3.3 INKORPORATION VON F^P] AUS [Y-^PJATP UND [ 3 H]LNOSITOL IN LJPID-
FRAKTION AUS DUNALIELLA PARVA 57
3.4 PL-KINASE UND PHYSIKALISCHE STIMULI 60
3.4.1 DIE PL-KINASEAKTIVITAET IM LICHT/DUNKEL-WECHSEL 60 3.4.2 DIE
ABHAENGIGKEIT DER PL-KINASEAKTIVITAET VON DER EXTERNEN NACI-KONZENTRATION
63
3.4.3 BEEINFLUSSUNG DER PL-KINASEAKTIVITAET DURCH OSMOTISCHEN SCHOCK 66
3.5 AUFREINIGUNG DER PL-KINASE 69
3.6 CHARAKTERISIERUNG DER PL-KINASE 73
3.6.1 DAS APPARENTE MOLEKULARGEWICHT DER PL-KINASE 74 3.6.2 DER
ISOELEKTRISCHE PUNKT DER PL KINASE NACH CHROMATO- FOKUSSIERUNG UND
LEF-GELELEKTROPHORESE 77
3.6.3 IDENTIFIZIERUNG DER PHOSPHORYLIERUNGSPOSITION 79 3.6.4 DER EINFLUSS
DIVALENTER KATIONEN AUF DIE PL-KINASEAKTIVITAET 83 3.6.5 DER EINFLUSS
MONOVALENTER KATIONEN AUF DIE PL-KINASEAKTIVITAET 87 3.6.6 DAS PH-OPTIMUM
DER PL-KINASE 89
3.6.7 DER EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE PL-KINASEAKTIVITAET IN
ABHAENGIGKEIT VON MANGANCHLORID 90
3.6.8 DIE STIMULATION DER PL-KINASE DURCH DETERGENZIEN 92 3.6.9 DIE
PL-KINASEAKTIVITAET IN GEGENWART VON GLYCERIN 94 3.6.10 ENZYMKINETISCHE
KONSTANTEN 95
3.7 LOKALISIERUNG VON PL-KINASE 102
IMAGE 4
INHALT
3.7.1 DIE PL-KINASEAKTIVITAET IN ISOLIERTEN PLASMAMEMBRANEN 102 3.7.2 DIE
LOESLICHKEIT DER PL-KINASE AUS DUNALIELLA PARVA 103 3.7.3 DIE
PL-KINASEAKTIVITAET IN EINER ANGEREICHERTEN CHLOROPLASTEN- FRAKTION 104
4 DISKUSSION 109
4.1 DIE ALGE DUNALLELLA PARVA 109
4.2 KULTIVIERUNG VON DUNALIELLA PARVA 110
4.3 REINIGUNG DER PL-KINASE 112
4.4 EIGENSCHAFTEN DER PL-KINASE 115
4.4.1 MOLEKULARGEWICHT 116
4.4.2 ISOELEKTRISCHER PUNKT 117
4.4.3 PHOSPHORYLIERUNGSPOSITION 117
4.4.4 DIVALENTE KATIONEN 118
4.4.5 MONOVALENTE KATIONEN 121
4.4.6 PH-WERT 122
4.4.7 DETERGENZIEN UND LJPIDE 123
4.4.8 GLYCERIN 124
4.4.9 TEMPERATUR 125
4.4.10 ANDERE SUBSTRATE 126
4.4.11 ENZYMKINETISCHE BETRACHTUNGEN . . 126
4.4.12 VERGLEICH DER PL-KINASE AUS DUNALIELLA MIT WEITEREN PFLANZLICHEN
PL-KINASEN 129
4.5 REGULATION DER PL-KINASE 131
4.5.1 REGULATION DURCH MANGAN 131
4.5.2 REGULATION DURCH PHOSPHOLIPIDE 133
4.5.3 REGULATION DURCH NUCLEOSIDE UND NUCLEOTIDE 133 4.5.4 REGULATION
DURCH ANDERE FAKTOREN 134
4.6 LOKALISATION DER PL-KINASE - 137
4.6.1 MEMBRANEN UND MIKROSOMEN 138
4.6.2 CHLOROPLASTEN 139
4.6.3 CYTOSOL 140
4.6.4 INTERMEMBRANRAUM ZWISCHEN CYTOSOL UND CHLOROPLASTEN 141 4.7 DIE
BETEILIGUNG DER PL-KINASE AN PHYSIOLOGISCHEN VORGAENGEN 142 4.7.1
ZELLTEILUNG 142
4.7.2 LICHTPHASENWECHSEL 143
4.7.3 OSMOREGULATION 144
4.8. AUSBLICK 148
5 ZUSAMMENFASSUNG 149
6 LITERATURVERZEICHNIS 151
IMAGE 5
INHALT
7 ANHANG A1
7.1 ABKUERZUNGEN A1
7.2 GERAETEVERZEICHNIS A3
7.3 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN A4
7.4 LEBENSLAUF A5
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