Untersuchungen zur Variabilität von gentechnisch veränderten Tabakpflanzen mit Resistenz- und Reportergenen:
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1992
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UNTERSUCHUNGEN ZUR VARIABILITAET VON
GENTECHNISCH VERAENDERTEN TABAKPFLANZEN MIT RESISTENZ- UND REPORTERGENEN
VOM FACHBEREICH GARTENBAU DER UNIVERSITAET HANNOVER
ZUR ERLANGUNG
DES AKADEMISCHEN GRADES EINES
DOKTORS DER GARTENBAUWISSENSCHAFTEN
- DR. RER. HOERT. -
GENEHMIGTE
DISSERTATION
VON
DIPL.-ING. AGR. CORNELIA A. VAN DER HOEVEN
GEBOREN AM 04.04.1962 IN HAMBURG
1992
IMAGE 2
I N H A L T S V E R Z E I C H N IS
SEITE
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 GERAETE 11
2.2 MATERIALIEN 12
2.3 CHEMIKALIEN 12
2.4 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE 14
2.5 PFLANZEN 14
2.6 MEDIEN FUER BAKTERIEN 14
2.7 MEDIEN FUER PFLANZEN 15
2.8 STERILISATION 16
2.9 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG VON BAKTERIEN 16
2.10 ANZUCHT UND ERHALTUNG VON PFLANZEN IN GEWEBEKULTUR 17 2.11
UEBERFUEHRUNG VON PFLANZEN AUS GEWEBE- IN ERDKULTUR 18
2.12 KULTIVIERUNG VON PFLANZEN IM GEWAECHSHAUS 18
2.13 DNA-EXTRAKTION AUS BAKTERIEN 19
2.13.1 PLASMIDPRAEPARATION AUS COLI 19
2.13.2 PLASMIDPRAEPARATION AUS A. TUMEFACIENS 20
2.14 DNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 20
2.15 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 22
2.16 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON BAKTERIEN-DNA 23
2.17 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON PFLANZEN-DNA 23
2.18 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG BAKTERIELLER DNA 24
2.19 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG PFLANZLICHER DNA 24
2.20 UEBERTRAGUNG DER DNA AUF EINE MEMBRAN (BLOTTING) 25
2.21 DNA-HYBRIDISIERUNG 26
2.21.1 NICHT-RADIOAKTIVER NACHWEIS MIT D IG 26
2.21.2 RADIOAKIVER NACHWEIS MIT 32 P 29
2.22 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 30
2.23 TRANSFORMATION VON E. COLI 31
2.24 DREI-PARENTALE-KREUZUNG MIT A. TUMEFACIENS 31
2.25 TRANSFORMATION VON PFLANZEN 34
2.26 HERSTELLUNG VON PFLANZENZELLEXTRAKTEN 35
2.27 PROTEINBESTIMMUNG 35
2.28 PHOTOMETRISCHER GUS-TEST 36
IMAGE 3
SEITE
2.29 FLUOROMETRISCHER GUS-TEST 37
2.30 HISTOCHEMISCHER GUS-TEST 37
2.31 NPTII-ELISA 38
2.32 PAT-TEST 40
2.33 HERBIZIDANWENDUNG 41
2.34 NITRATREDUKTASE-TEST 41
3 ERGEBNISSE 43
3.1 TRANSFORMATION VON N. TABACUM W38 MIT 43
A. TUMEFACIENS PARGUSH UND REGENERATION GANZER PFLANZEN 3.2 ANALYSE DER
TRANSFORMIERTEN PARGUSH-PFLANZEN 43
3.2.1 PHOTOMETRISCHE GUS-TESTS 44
3.2.1.1 TESTS VON EINZELPFLANZEN 45
3.2.1.2 MEHRMALIGE TESTS DERSELBEN PFLANZEN 51
3.2.1.3 TESTS VERSCHIEDENER PFLANZENTEILE 51
3.2.1.4 FEHLERBETRACHTUNG 54
3.2.2 UNTERSUCHUNG VON PARGUSH-REGENERATEN OHNE WURZELN 55 3.2.3
VERGLEICH DES PHOTOMETRISCHEN MIT DEM 57
FLUOROMETRISCHEN GUS-TEST 3.2.4 VERGLEICH DER EXPRESSION VON
PAR-PROMOTOR/GUS-GEN UND 58 35S-PROMOTOR/GUS-GEN 3.2.5 NPTII-TESTS 59
3.2.5.1 TESTS VON EINZELPFLANZEN 61
3.2.5.2 MEHRMALIGE TESTS DERSELBEN PFLANZEN 66
3.2.5.3 TESTS VERSCHIEDENER PFLANZENTEILE 66
3.2.5.4 FEHLERBETRACHTUNG 69
3.2.6 SIMULTANE GUS- UND NPTII-TESTS 70
3.2.7 VERGLEICH DER SPROSSREGENERATIONSORTE MIT DER GUS- UND 72
NPTII-EXPRESSION 3.2.8 ANALYSE DER GENKOPIENZAHL VON PARGUSH-PFLANZEN 77
3.2.8.1 BESTIMMUNG DER GENKOPIENZAHL 77
3.2.8.2 VERGLEICH DER GENKOPIENZAHL MIT DER GUS- UND NPTII- 81
EXPRESSION 3.2.9 VERGLEICH DES GESAMTPROTEINGEHALTES VON PFLANZENZELL-
83 EXTRAKTEN MIT DER GUS- UND NPTII-EXPRESSION VON
PARGUSH-PFLANZEN
IMAGE 4
SEITE
3.3 UNTERSUCHUNG DER PLASMIDE IN DEN ZUR PARGUSH- 83
PFLANZENTRANSFORMATION VERWENDETEN AGROBAKTERIEN 3.4 REISOLIERUNG UND
IDENTIFIZIERUNG VON BAKTERIEN AUS 85
PFLANZENKULTUREN NACH DER PARGUSH-TRANSFORMATION 3.5 TEST DER
FUNKTIONALITAET DER REISOLIERTEN AGROBAKTERIEN 87
3.5.1 RETRANSFORMATION VON N. TABACUM W38 UND GUS-TEST 87 3.5.2
GENEXPRESSION IN BAKTERIEN 89
3.5.2.1 GUS-TEST MIT BAKTERIEN 89
3.5.2.2 NPTII-ELISA MIT BAKTERIEN 93
3.6 TRANSFORMATION VON N. TABACUM W38 MIT 94
A. TUMEFACIENS PARBASTA UND REGENERATION GANZER PFLANZEN 3.7 ANALYSE DER
TRANSFORMIERTEN PARBASTA-PFLANZEN 94
3.7.1 PAT-TESTS 95
3.7.1.1 TESTS VON EINZELPFLANZEN 96
3.7.1.2. MEHRMALIGE TESTS DERSELBEN PFLANZEN 100
3.7.1.3 TESTS VERSCHIEDENER PFLANZENTEILE 100
3.7.1.4 FEHLERBETRACHTUNG 103
3.8 HERBIZID-APPLIKATIONSVERSUCHE 104
3.8.1 ^ AUFWANDMENGE 5 L/HA BASTA 105
3.8.2 AUFWANDMENGE 20 L/HA BASTA 105
3.9 NITRATREDUKTASE-TESTS UNTRANSFORMIERTER TABAKPFLANZEN 108
4 DISKUSSION 111
5 ZUSAMMENFASSUNG 131
6 LITERATURVERZEICHNIS 134
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