Elektrophysiologische Untersuchung spannungsabhängiger Kanäle an hippocampalen Kulturen von neugeborenen Ratten mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik:
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1993
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ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG SPANNUNGSABHAENGIGER KANAELE
AN HIPPOCAMPALEN KULTUREN VON NEUGEBORENEN RATTEN
MIT HILFE DER PATCH-CLAMP-TECHNIK
INAUGURAL-DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE
DES
FACHBEREICHES PHARMAZIE UND LEBENSMITTELCHEMIE
DER PHILIPPS-UNIVERSITAET MARBURG
VORGELEGT VON
UTE LIPPERT, GEB. BACHMANN
AUS DARMSTADT
MARBURG/LAHN 1993
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS SEITE
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 TIERE UND TIERHALTUNG 11
2.2 SUBSTANZEN 11
2.2.1 SUBSTANZEN, DIE IN DER ZELLKULTUR VEWENDET WURDEN 11
2.2.2 SUBSTANZEN, DIE FUER ELEKTROPHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN VERWENDET
WURDEN 12
2.3 ZELLKULTUR 12
2.3.1 ALLGEMEINE ARBEITSTECHNIKEN 12
2.3.2 KULTIVIERUNG HIPPOCAMPALER ZELLEN 13
2.3.2.1 NAEHRMEDIEN UND LOESUNGEN 14
2.3.2.2 ANLEGEN EINER HIPPOCAMPALEN NEURONENKULTUR AUF EINEM COR-
TEX-GLIARASEN 15
2.3.2.3 ANLEGEN EINER HIPPOCAMPALEN NEURONENKULTUR AUF HIPPOCAMPALEN
GLIAZELLEN 18
2.4 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE ABLEITUNGEN AN HIPPOCAMPALEN KULTUREN 19
2.4.1 STANDARDLOESUNGEN FUER ELEKTROPHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN 19
2.4.1.1 INTRAZELLULAERLOESUNGEN 19
2.4.1.2 EXTRAZELLULAERLOESUNGEN 20
2.4.1.3 HERSTELLUNG UND LAGERUNG 20
2.4.2 DAS MESSSYSTEM 22
2.4.3 DER ARBEITSPLATZ 23
I
IMAGE 3
2.4.4 DIE MESSKAMMER 23
2.4.5 DIE REFERENZELEKTRODE 25
2.4.6 DIE PIPETTEN 26
2.4.6.1 GLASSORTEN 26
2.4.6.2 DER PULLER 27
2.4.6.3 DAS UEBERZIEHEN ( COATING ) 28
2.4.6.4 DAS POLIEREN 28
2.4.6.5 FUELLTECHNIKEN UND FUELLHOEHE 28
2.4.7 DIE SONDE 29
2.4.7.1 DIE MESSELEKTRODE 29
2.4.7.2 DER PIPETTENHALTER 31
2.4.7.3 DER MIKROMANIPULATOR 31
2.4.8 MESSPROGRAMME 32
2.4.8.1 DER COMPUTER 32
2.4.8.2 DAS MESSPROGRAMM 32
AUSWAHL DER MESSPARAMETER 33
DEFINITION VON SPRUNGSEQUENZEN 34
DIE SEALBILDUNG 34
2.4.8.3 VORAUSSETZUNGEN FUER DIE VERWERTBARKEIT VON MESSUNGEN 38
2.4.9 AUSWERTUNG 39
2.4.10 DIE ERDUNG 39
2.5 VALIDIERUNG DER ARZNEISTOFFAPPLIKATION UND -ELIMINATION MIT
VERSCHIEDENEN ZUGABESYSTEMEN 40
2.5.1 DIREKTE ZUGABE ZUR BADLOESUNG 40
2.5.2 DRUCKAPPLIKATION UEBER EINE ZWEITE PIPETTE 41
2.5.3 ARZNEISTOFFAPPLIKATION PER DURCHFLUSS 42
2.6 KORRELATION DER RAUMTEMPERATUR MIT DER TEMPERATUR IN DER
MESSKAMMER 45
II
IMAGE 4
2.7 BESTIMMUNG DER AUSTAUSCHGESCHWINDIGKEIT DES INTRAZELLULAEREN
MILIEUS MIT DER LOESUNG IN DER PATCH-PIPETTE 47
3. ERGEBNISSE 50
3.1 UNTERSUCHUNG DER IONENSTROEME SPANNUNGSABHAENGIGER KANAELE AN
HIPPOCAMPALEN NEURONEN 50
3.1.1 ABLEITUNG VON GRUNDSTROEMEN 50
3.1.2 WIRKUNG DES NATRIUM-KANAL-BLOCKERS TETRODOTOXIN (TTX) 51
3.1.3 ISOLIERUNG VON DREI VERSCHIEDENEN CALCIUM-STROEMEN 53
3.1.3.1 WIRKUNG VON BARIUM AUF DIE CALCIUM-STROEME 59
3.1.4 ABLEITUNG VON KALIUM-STROEMEN 61
3.1.4.1 VERSUCHE MIT DEM KALIUM-KANAL-BLOCKER TETRAETHYLAMMONIUM
(TEA) 61
3.1.4.2 VERSUCHE MIT DEM KALIUM-KANAL-BLOCKER 4-AMINOPYRIDIN (4-AP) 63
3.1.4.3 VERSUCHE ZUR INAKTIVIERUNG DES TRANSIENTEN KALIUM-STROMES 66
INAKTIVIERUNG DURCH DEPOLARISATION DER ZELLE 66
INAKTIVIERUNG DURCH DEN ABSTAND ZWEIER AUFEINANDERFOLGENDER
POTENTIALSPRUENGE 68
3.2 UNTERSUCHUNG VON ARZNEISTOFFEFFEKTEN AUF SPANNUNGSABHAENGIGE
KALIUM-STROEME 72
3.2.1 VERSUCHE MIT CROMAKALIM 72
3.2.1.1 UNTERSUCHUNG DER KANALSELEKTIVITAET 72
3.2.1.2 UNTERSUCHUNG DER CROMAKALIM-WIRKUNG IN ABHAENGIGKEIT VON DER
ANGELEGTEN SPANNUNG 74
3.2.1.3 UNTERSUCHUNG DES ZEITVERLAUFS DER CROMAKALIM-WIRKUNG 76
3.2.2 VERSUCHE MIT BIMAKALIM 78
3.2.3 VERSUCHE MIT EMD 57283 80
III
IMAGE 5
3.2.4 VERSUCHE MIT ROXINDOL 81
3.2.4.1 WIRKUNG AUF SPANNUNGSABHAENGIGE KALIUM-KANAELE 81
3.2.4.2 UNTERSUCHUNG DES ZEITVERLAUFS DER ROXINDOLWIRKUNG 87
3.2.4.3 WIEDERHOLTE APPLIKATION VON ROXINDOL AN EIN UND DERSELBEN ZELLE
90
4. DISKUSSION 92
4.1 DISKUSSION DER METHODE 92
4.1.1 DISKUSSION DER PATCH-CLAMP-TECHNIK 92
ALLGEMEINE ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN 92
4.1.2 DISKUSSION DER VERWENDETEN ZELLKULTUR 95
BESONDERE STELLUNG DES HIPPOCAMPUS 95
EIGNUNG DER HIPPOCAMPALEN ZELLEN FUER DIE PATCH-CLAMP-MESSUNGEN 96
4.1.3 DISKUSSION DES VERWENDETEN VERSUCHSANORDNUNG 97
4.1.3.1 DISSOZIIERTE ZELLEN 97
4.1.3.2 GANZZELLABLEITUNG 98
4.1.3.3 SPANNUNGSABHAENGIGE KANAELE 99
4.1.4 DISKUSSION DER ARZNEIMITTEL-APPLIKATION UND -ELIMINATION MIT
VERSCHIEDENEN ZUGABESYSTEMEN 100
DIREKTE ZUGABE 100
DRUCKAPPLIKATION 101
ZUGABE PER DURCHFLUSS 101
4.1.5 DISKUSSION DER TEMPERATURKONTROLLE 103
4.1.6 DISKUSSION DER AUSTAUSCHGESCHWINDIGKEIT DES INTRAZELLULAEREN
MILIEUS MIT DER PIPETTENLOESUNG 103
4.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE 105
4.2.1 DISKUSSION DER MESSUNGEN AN SPANNUNGSABHAENGIGEN KANAELEN
HIPPOCAMPALER NEURONE 105
IV
IMAGE 6
4.2.1.1 CALCIUM-KANAELE 106
ISOLIERUNG VON DREI CALCIUM-KANALTYPEN 107
DISKUSSION DER WIRKUNG VON BARIUM 109
4.2.1.2 KALIUM-KANAELE 110
EINTEILUNG UND FUNKTION 111
4.2.1.2.1 DISKUSSION DER ERGEBNISSE MIT TEA UND 4-AP 113
4.2.1.2.2 DISKUSSION DER INAKTIVIERUNGSVERSUCHE 115
4.2.2 DISKUSSION DER ARZNEISTOFFEFFEKTE 116
4.2.2.1 KALIUM-KANAL-OEFFNER 117
4.2.2.1.1 DISKUSSION DER ERGEBNISSE MIT CROMAKALIM 118
4.2.2.1.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE MIT BIMAKALIM UND EMD 57283 120
4.2.2.2 SEROTONIN-AGONISTEN 122
4.2.2.2.1 DISKUSSION DER ERGEBNISSE MIT ROXINDOL 124
4.2.2.2.2 DISKUSSION DER SELEKTIVITAET DER ROXINDOL-WIRKUNG 126
4.2.2.2.3 DISKUSSION DER WIEDERHOLTEN APPLIKATION VON ROXINDOL 126
5. ZUSAMMENFASSUNG 128
6. LITERATUR 131
V
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