Analyse der Primärstrukturen chloroplastidärer Phosphat-Translokatoren aus C 3 - und C 4 -Pflanzen:
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ANALYSE DER PRIMARSTRUKTUREN
CHLOROPLASTIDAEKER PHOSPHAT- TRANSLOKATOREN AUS C 3 - UND C 4 -PFLANZEN
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER BAYERISCHEN JULIUS-MAXIINILIANS UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
KARSTEN FISCHER
AUS
WULFTEN
WUERZBURG 1992
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1.1. DIE PHYSIOLOGISCHE FUNKTION DER PLASTIDAEREN PHOSPHAT-
TRANSLOKATOREN 1
1.2. DIE PHOSPHATTRANSLOKATOR PROTEINE 7
1.3. PROTEINIMPORT IN CHLOROPLASTEN 9
1.4. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 11
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. MATERIALIEN 12
2.2. REINIGUNG UND ANALYSE VON DNA 13
2.2.1. PHENOLEXTRAKTION UND ETHANOLFAELLUNG 13
2.2.2. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 13
2.2.3. ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 14 2.2.4.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG UND LAGERUNG VON DNA 15 2.2.5.
BLOTTING-VERFAHREN 15
2.2.5.1. SOUTHERN BLOT 15
2.2.5.2. NORTHERN BLOT 16
2.2.6. HYBRIDISIERUNG 17
2.2.6.1. HYBRIDISIERUNG MIT DOPPELSTRAENGIGER DNA 17 2.2.6.2.
HYBRIDISIERUNG MIT OLIGONUKLEOTIDEN 18
2.3. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 19
2.3.1. SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 19
2.3.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 19
2.3.3. LIGATION 20
2.3.4. UEBERFUEHRUNG UEBERHAENGENDER IN GLATTE ENDEN ( FUEL IN ) 20 2.3.5.
PHOSPHORYLIERUNG VON DNA (KINASIERUNG) 21
2.3.6. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA 22
2.3.7. DELETIONEN MIT EXONUKLEASE III UND SL-NUKLEASE 23 2.3.8.
DNA-SEQUENZIERUNG 24
2.4. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 27
2.4.1. ANZUCHT, AUSPLATTIERUNG UND LAGERUNG VON BAKTERIEN 27
IMAGE 3
2.4.2. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 28
2.4.3. TRANSFORMATION 28
2.4.4. ANALYTISCHE PRAEPARATION VON PLASMIDEN 29
2.4.5. PRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 30
2.5. ISOLIERUNG VON RNA UND DNA AUS PFLANZEN 31
2.5.1. ISOLIERUNG VON RNA 31
2.5.1.1. SDS-PHENOL-METHODE 31
2.5.1.2. GUANIDINIUMTHIOCYANAT-METHODE 32
2.5.2. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA 34
2.6. ANLAGE UND DURCHMUSTERUNG VON CDNA-BANKEN 35 2.6.1. CDNA-SYNTHESE
35
2.6.2. LIGATION UND VERPACKUNG 36
2.6.3. AUSPLATTIERUNG UND LAGERUNG VON PHAGEN 38
2.6.4. DURCHMUSTERUNG VON CDNA-BANKEN 39
2.6.5. ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA 40
2.7. DIE POLYMERASE-KETTENREAKTION 41
3. ERGEBNISSE
3.1. DER PHOSPHATTRANSLOKATOR AUS SPINATCHLOROPLASTEN 43 3.1.1.
VORBEMERKUNGEN 43
3.1.2. AUSGANGSMATERIAL 44
3.1.3. DURCHMUSTERUNG DER CDNA-BANKEN VON SPINAT 48 3.1.4. ANALYSE DER
SEQUENZ DES PHOSPHATTRANSLOKATORS AUS SPINAT 55
3.2. DER PHOSPHATTRANSLOKATOR AUS ERBSENCHLOROPLASTEN 63 3.3. DER
PHOSPHATTRANSLOKATOR AUS MAIS 71
3.3.1. VORBEMERKUNGEN 71
3.3.2. CDNA-BANKEN, PCR UND ISOLIERUNG DER KLONE 73 3.3.3. ANALYSE DER
SEQUENZEN ZWEIER PHOSPHATTRANSLOKATOREN AUS MAIS 83
3.4. DER PHOSPHATTRANSLOKATOR AUS FLAVERIA TXINERVIA 90 3.5. VERGLEICH
DER PHOSPHATTRANSLOKATOREN 96
3.5.1. BENUTZUNG DER KODONS ( CODON USAGE ) 96
3.5.2. VERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZEN 98
3.5.2.1. VERGLEICH DER PRAESEQUENZEN 103
3.5.2.2. VERGLEICH DER SEQUENZEN DER REIFEN PROTEINE 104
IMAGE 4
4. DISKUSSION
4.1. ISOLIERUNG VON PHOSPHATTRANSLOKATOR KLONEN 107
4.1.1. DURCHMUSTERUNG DER CDNA-BANKEN MIT ANTIKOERPERN GEGEN DEN
PHOSPHATTRANSLOKATOR 108
4.1.2. DURCHMUSTERUNG DER CDNA-BANKEN MIT OLIGONUKLEOTIDEN 109 4.2. ZUR
IDENTITAET DER PHOSPHATTRANSLOKATOR KLONE 111
4.3. ABLEITUNG EINES TOPOLOGISCHEN MODELLS DES PHOSPHATTRANS- LOKATOR
PROTEINS AUS SPINAT AUS DER AMINOSAEURESEQUENZ 115 4.4. PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION UND VERWANDTSCHAFT DER PHOSPHAT- TRANSLOKATOREN 121
4.5. IMPORT DES PHOSPHATTRANSLOKATORS IN CHLOROPLASTEN 126
5. ZUSAMMENFASSUNG 130
6. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 133
7. LITERATURVERZEICHNIS 136
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