Stabilität und Faltung von Creatinase aus Pseudomonas putida: vergleichende Untersuchungen von Wildtyp-Enzym und thermostabilen Punktmutanten
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Sprache: | Undetermined |
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1992
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Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN 1
H EINLEITUNG 3
1 PROTEINFALTUNG 3
1.1 DER "FALTUNGSCODE" 3
1.2 DER HIERARCHISCHE FALTUNGSWEG 3
1.2.1 DER ZUSTAND DES "MOLTEN GLOBULE" ALS FALTUNGSINTERMEDIAT 4
1.2.2 FALTUNG UND ASSOZIATION OLIGOMERER PROTEINE 3
2 PROTEINSTABILITAET 6
2.1 STABILISIERENDE KRAEFTE IM NATIVEN ZUSTAND 6
2.2 AUFKLAERUNGSMOEGLICHKEITEN FUER STABILISIERENDE WECHSELWIRKUNGEN 7
2.3 MOEGLICHKEITEN DER STABILISIERUNG VON PROTEINEN 8
2.1.1 INTRINSISCHE STABILISIERUNG 8
2.1.2 EXTRINSISCHE STABILISIERUNG 10
3 CREATINASE 11
3.1 KLINISCHE BEDEUTUNG VON CREATINASE 11
3.2 STRUKTUR UND ENZYMATISCHE REAKTION VON CREATINASE AUS
PSEUDOMONAS PUTIDA 12
3.3 UNTERSUCHTE PUNKTMUTANTEN VON CREATINASE AUS PSEUDOMONAS PUTIDA 13
4 PROBLEMSTELLUNG 15
HI MATERIALIEN UND METHODEN 17
1 MATERIALIEN 17
2 GERAETE 17
3 REINIGUNG VON CREATINASE 18
4 BEDINGUNGEN FUER STABILE CREATINASE IN LOESUNG 19
5 CREATINASE-AKTIVITAETSTESTS 19
5.1 SARCOSIN-NACHWEIS 19
5.2 HARNSTOFF-NACHWEIS 20
5.3 DIREKTER CREATIN-NACH WEIS 21
5.4 K
M-WERT 21
5.5 AKTIVIERUNGSENERGIE 21
6 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 22
6.1 UV-ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE 22
6.1.1 ABSORPTIONSSPEKTREN 22
6.1.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 22
6.1.3 LICHTSTREUUNG 23
6.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 23
6.2.1 INTRINSISCHE FLUORESZENZ 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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6.2.2 LICHTSTREUUNG
**
6.2.3 EXTRINSISCHE FLUORESZENZ DURCH FARBSTOFFBINDUNG 24
6.2.4 QUENCHING DER INTRINSISCHEN PROTEINFLUORESZENZ 24
6.3 CIRCULARDICHROISMUS (CD-SPEKTROSKOPIE) 25
7 STABILITAETSMESSUNGEN 25
7.1 GLEICHGEWICHTS-DENATURIERUNGSUEBERGAENGE IN GDMCL UND HARNSTOFF 26
7.2 TEMPERATUR-UEBERGAENGE 27
7.3 KALORIMETRIE 27
8 KINETISCHE MESSUNGEN 28
8.1 INTERMEDIAERE GDMCL-KONZENTRATIONEN 28
8.2 TEMPERATURSPRUNG-EXPERIMENTE 29
9 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION 29
9.1 SEDIMENTATIONSGESCHWINDIGKEIT 29
9.2 SEDIMENTATIONSGLEICHGEWICHT 30
10 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 30
10.1 GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE 30
10.2 ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE 30
11 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE) 30
11.1 SDS-PAGE 31
11.2 IEF-PAGE 31
IV ERGEBNISSE UND DISKUSSION 32
1 CHARAKTERISIERUNG VON CREATINASE WILDTYP-PROTEIN 32
1.1 SPEKTROSKOPISCHER VERGLEICH VON NATIVER UND DENATURIERTER CREATINASE
32
1.1.1 UV-ABSORPTION 32
1.1.2 FLUORESZENZEMISSION , 33
1.1.3 CIRCULARDICHROISMUS 34
1.1.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER SPEKTROSKOPISCHEN EIGENSCHAFTEN 35
1.2 GDMCL-DENATURIERUNG 35
1.2.1 AKTIVITAETSUEBERGANG 36
1.2.2 AGGREGATIONSVERHALTEN UND QUARTAERSTRUKTUR 37
1.2.3 SEKUNDAERSTRUKTURUEBERGANG (FEM-UV-CD) 39
1.2.4 AENDERUNGEN DER AROMATENUMGEBUNG (FLUORESZENZEMISSION) 40
1.2.5 ZUSAMMENFASSENDES MODELL DER GDMCL-DENATUNERUNG 40
13 HARNSTOFF-DENATURIERUNG 42
1.3.1 AKTIVITAETSUEBERGANG 42
1.3.2 AGGREGATIONSVERHALTEN 43
1.3.3 SEKUNDAERSTRUKTURUEBERGANG (FEM-UV-CD) 44
1.3.4 AENDERUNGEN DER AROMATENUMGEBUNG (FLUORESZENZEMISSION) 45
1.3.5 ZUSAMMENFASSENDES MODELL DER HARNSTOFF-DENATURIERUNG 45
1.4. THERMISCHE DENATURIERUNG
1.4.1
TEMPERATURUEBERGAENGE
1.4.1.1
AKTIVITAETSUEBERGAENGE
1.4.1.2
AGGREGATIONSVERHALTEN
1.4.2 KINETISCHE MESSUNGEN (TEMPERATURSPRUNG-EXPERIMENTE)
1.4.2.1
DESAKTIVIERUNGSKINETIK
1.4.2.2 KINETIK DER AGGREGATION
1 4 3 INTERMEDIAT DER THERMISCHEN INAKTIVIERUNG (IJ)
1.4.4 ZUSAMMENFASSENDES MODELL DER THERMISCHEN DENATURIERUNG
US
EINFLUSS VON GLYCERIN AUF CREATINASE
1.5.1 EINFLUSS AUF NATIVE CREATINASE
1.5.2 EINFLUSS
UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN
1.5.2.1 AKTIVITAET
1.5.2.2 AGGREGATION
1.5.2.3
FLUORESZENZEMISSION
1.5.3
ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER GLYCENNEMFLUSSE
1.6 RENATURIERUNGSVERHALTEN VON CREATINASE
161
REAKTIVIERUNGSVERSUCHE
1*6.2
DE-
UND RENATURIERUNGSUEBERGAENGE (GDMCL UND HARNSTOFF)
1 6.2.1
AENDERUNGEN DER AROMATENUMGEBUNG (FLUORESZENZENUSSION)
1
6.2.2
AENDERUNGEN DER SEKUNDAERSTRUKTUR
(FEM-UV-CD)
16 3 CHARAKTERISIERUNG DES RENATURIERTEN ZUSTANDS (R)
16 4
ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER RENATURIERUNGSVEREUCHC
,.7 CHARAKTERISIERUNG DES SAUREN ZUSTANDS ("_A-STATE") VON CREAUNAS
17.1 VERGLEICH VON NATIVEM ZUSTAND UND "A-STATE
1.7.1U SPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN
1.7.1.2 HYDROPHOBE OBERFLAECHE UND PROTEINDYNAMIK
1.7.2 STABILITAETSVERHALTEN DES SAUREN ZUSTANDS
1 7.2.1 GDMCL-UEBERGAENGE BEI NIEDRIGER IONENSTAERKE
17 22 HARNSTOFF-UEBERGAENGE BEI HOHER IONENSTAERKE
1.7.2.3 SALZEINFLUSS AUF DIE STABILITAET DES SAUREN ZUSTANDS
1 7.2.4 ASSOZIATIONSVERHALTEN DES SAUREN ZUSTANDS
17 2 5 REVERSIBILITAET DER DENATUNERUNGSUEBERGAENGE
17 3 PH-ABHAENGIGE KONFORMATIONSAENDERUNGEN VON CREATINASE
1.7.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DES SAUREN ZUSTANDS
47
47
47
49
50
50
51
52
54
55
55
57
57
61
61
62
63
63
63
64
65
66
68
69
69
69
71
73
73
74
76
76
78
78
79
2.1
2
.
1.1
S^'AEBSSSSSSSAE .
REINHEIT UND HOMOGENITAET DER PROTEINE G3
GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE
2.1.2 ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
83
2.1.3 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
84
2.1.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION VON REINHEIT UND HOMOGENITAET 84
22 VERGLEICH DER ENZYMATISCHEN EIGENSCHAFTEN 84
23
VERGLEICH DER SPEKTROSKOSKOPISCHEN EIGENSCHAFTEN 85
2.4 VERGLEICH DER GDMCL-DENATURIERUNGSUEBERGAENGE 86
2.4.1 AKTIVITAETSUEBERGAENGE
86
2.4.2 AGGREGATIONSVERHALTEN
87
2.4.2.1 GLEICHGEWICHTSDENATURIERUNGEN
87
2.4.2.2 KINETISCHE MESSUNGEN
88
2.4.3 SEKUNDAERSTRUKTURUEBERGAENGE (FEM-UV-CD) 90
2.4.4 AENDERUNGEN DER AROMATENUMGEBUNG (FLUORESZENZEMISSION) 91
2.4.5 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER GDMCL-DENATURIERUNGEN 92
23 VERGLEICH DER HARNSTOFF-DENATURIERUNGSUEBERGAENGE 92
2.5.1 AKTIVITAETSUEBERGAENGE 93
2.5.2 SEKUNDAERSTRUKTURUEBERGAENGE (FEM-UV-CD) 93
2.5.3 AENDERUNGEN DER AROMATENUMGEBUNG (FLUORESZENZEMISSION) 93
2.5.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER HARNSTOFF-DENATURIERUNGEN 95
2.6 VERGLEICH DER THERMISCHEN DENATURIERUNGSUEBERGAENGE 95
2.6.1 KALORIMETRISCHE MESSUNGEN 95
2.6.2 THERMISCHE DESAKTIVIERUNGEN 96
2.6.2.1 TEMPERATURUEBERGAENGE 96
2.6.2.2 KINETISCHE MESSUNGEN 97
2.6.2.3 AKTIVIERUNGSENERGIE
98
2.6.3 THERMISCHE AGGREGATION 99
2.6.3.1 TEMPERATURUEBERGAENGE 99
2.6.3.2 KINETISCHE MESSUNGEN
100
2.6.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER THERMISCHEN DENATURIERUNGEN 101
2.7 VERGLEICHENDE STRUKTURBETRACHTUNGEN
2.7.1
LOKALE
VERAENDERUNGEN DURCH DIE AMINOSAEUREAUSTAUSCHE 102
2.7.2 LOKALISATION DER AMINOSAEUREAUSTAUSCHE
103
2.7.3 EINFLUSS DER AMINOSAEUREAUSTAUSCHE AUF DIE GESAMTSTRUKTUR 104
2.7.4 ZUSAMMENFASSUNG DER STRUKTURBETRACHTUNGEN 105
2.8 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER VERGLEICHENDEN UNTERSUCHUNGEN 105
V ZUSAMMENFASSUNG
109
VI LITERATURVERZEICHNIS
113 |
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