Pyruvat-Oxidase aus Lactobacillus plantarum: Quartärstruktur, Cofaktorbindung und stabilisierende Punktmutationen
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INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG
1. STABILITAET VON PROTEINEN
1
1.1 UNTERSUCHUNG DER STABILITAET VON PROTEINEN 3
2. PYRUVAT-OXIDASE 6
2.1 VORKOMMEN 6
2.2 STRUKTUR DER PYRUVAT-OXIDASE AUS
LACTOBACILLUS PLANTARUM 7
2.3 ENZYMATISCHE REAKTION 8
2.4 KLINISCHE BEDEUTUNG G
2.5 PUNKTMUTANTEN DER PYRUVAT-OXIDASE 10
3. PROBLEMSTELLUNG 11
II. MATERIAL UND METHODEN
1. MATERIAL 12
1.1 ENZYME 12
1.2 CHEMIKALIEN 12
1.3 CHROMATOGRAPHISCHE-MATERIALIEN
1
2
1.4 SONSTIGE VERBRAUCHSMATERIALIEN
1
3
1.5 GERAETE
13
1.5.1 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGE 13
1.5.2 KALORIMETRIE
13
1.5.3 CHROMATOGRAPHIE 13
1.5.4 GEIELEKTROPHORESE 14
1.5.5 SPEKTROSKOPIE
1
5
1.5.6 SONSTIGE GERAETE 15
2. METHODEN 15
2.1 PROTEIN-PRAEPARATION 15
2.1.1 PRAEPARATION VON HOLO-PYRUVAT-OXIDASE 15
2.1.2 PRAEPARATION VON APO-PYRUVAT-OXLDASE 15
2.2 PROTEINBESTIMMUNG 16
2.3 PYRUVAT-OXIDASE-AKTIVITAETSTEST 17
2.4 METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER MOLEKULAREN MASSE 18
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.4.1 HPLC-GELFILTRATION 18
2.4.2 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGE 19
2.4.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 21
2.5 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 22
2.5.1 ABSORPTIONSMESSUNGEN 22
2.5.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 23
2.5.2.1 NIL ROT FLUORESZENZ 24
2.5.3 CIRCULAR-DICHROISMUS 25
2.6 METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER COENZYM-BINDUNGSKONSTANTEN 26
2.6.1 GLEICHGEWICHTSDIALYSE 26
2.6.2 FLUORIMETRISCHE BESTIMMUNG DER FAD BINDUNG 27
2.6.3 BESTIMMUNG DER FAD BINDUNG IN GEGENWART VON TPP
UEBER DIE AKTIVITAET 28
2.6.4 BESTIMMUNG DER TPP BINDUNG IN GEGENWART VON FAD
UEBER DIE AKTIVITAET 29
2.7 REASSOZIATIONS- UND REAKTIVIERUNGSKINETIK DES APOENZYMS 29
2.8 LANGZEITSTABILITAET DER NATIVEN PYRUVAT-OXIDASE 30
2.9 DENATURIERUNGSMITTEL- UND PH-INDUZIERTE UEBERGAENGE 30
2.9.1 KINETIK DER DENATURIERUNG IN 3 M HARNSTOFF 31
2.10 TEMPERATUR-INDUZIERTE UEBERGAENGE
31
2.10.1 KALORIMETRIE
31
2.11 KRISTALLISATION DER PYRUVAT-OXIDASE 32
III. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
*
A. CHARAKTERISIERUNG DER WILDTYP-PYRUVAT-OXIDASE AUS
LACTOBACILLUS PLANTARUM
1. PRAEPARATION DES APOENZYMS
34
2. CHARAKTERISIERUNG VON HOLO- UND APOENZYM IM NATIVEN
UND DENATURIERTEN ZUSTAND
35
2.1 UNTERSUCHUNG DER QUARTAERSTRUKTUR
35
2.1.1 HOLO- UND APOENZYM IM VERGLEICH ZUR DENATURIERTEN
PYRUVAT-OXIDASE
35
2.1.2 EINFLUSS DER COFAKTOREN AUF DAS ASSOZIATIONS
GLEICHGEWICHT DES APOENZYMS
39
2.2
SPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN
40
2.2.1
ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE
40
2
.
2.2
FLUORESZENZEMISSIONSSPEKTROSKOPIE
43
2.2.2
.1
NIL ROT FLUORESZENZ
44
2.2.3 CIRCULAR DICHROISMUS
45
2.3 DISKUSSION
45
3. COENZYM-BINDUNG UND REAKTIVIERUNG DER PYRUVAT-OXIDASE
AUSGEHEND VOM STRUKTURIERTEN APOENZYM
49
3.1 FAD-BINDUNG
4
G
3.2 TPP-BINDUNG
52
3.3 EINFLUSS VON DIVALENTEN KATIONEN AUF DIE
REAKTIVIERUNG DES APOENZYMS
54
3.4 REAKTIVIERUNGSMECHANISMUS DER PYRUVAT-OXIDASE 56
3.5 DISKUSSION
53
4. STABILITAET DER PYRUVAT-OXIDASE
67
4.1 LANGZEITSTABILITAET IN ABHAENGIGKEIT VON PH UND SALZEN 67
4.1.1 PH-STABILITAET 67
4.1.2 EINFLUSS VON SALZEN AUF DIE AKTIVITAET 70
4.1.3 DISKUSSION 72
4.2 STABILITAET GEGENUEBER DENATURIERUNGSMITTELN
73
4.2.1 EINFLUSS VON GLYCERIN UND PHOSPHATIONEN
AUF DIE STABILITAET IN HARNSTOFF
74
4.2.2 VERGLEICH DER HAMSTOFF-STABIIITAET VON
HOLO- UND APOENZYM 78
4.2.3 HARNSTOFF-UEBERGANG IM FERN-UV-CIRCULAR DICHROISMUS 79
4.2.4 EINFLUSS DER COFAKTOREN AUF DIE STABILITAET DER
PYRUVAT-OXIDASE IN HARNSTOFF 80
4.2.5 STABILITAET DER PYRUVAT-OXIDASE IN GUANIDINIUM-
HYDROCHLORID 83
4.2.6 DISKUSSION 85
4.3 THERMISCHE STABILITAET 87
4.3.1 IRREVERSIBLE THERMISCHE DENATURIERUNG 87
4.3.2 EINFLUSS DER COFAKTOREN AUF DIE THERMISCHE DENATURIERUNG 88
4.3.3 ABHAENGIGKEIT DER THERMISCHEN DESAKTIVIERUNG
UND DENATURIERUNG VON DER PROTEINKONZENTRATION 90
4.3.4 DISKUSSION
93
B. CHARAKTERISIERUNG VON PUNKTMUTANTEN DER PYRUVAT-OXIDASE
AUS
LACTOBACILLUS PLANTARUM
5. STRUKTUR, STABILITAET UND COFAKTOR-BINDUNG DER PUNKTMUTANTEN 95
5.1 SPEKTROSKOPISCHE UND ENZYMATISCHE EIGENSCHAFTEN DER
PUNKTMUTANTEN IM VERGLEICH ZUR WILDTYP-PYRUVAT-OXIDASE 96
5.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR STABILITAET DER PUNKTMUTANTEN
IM VERGLEICH ZUM WILDTYP-ENZYM 99
5.2.1 PH-STABILITAET 99
5.2.2 STABILITAET DER PUNKTMUTANTEN GEGENUEBER HARNSTOFF 100
5.2.3 THERMISCHE STABILITAET DER PUNKTMUTANTEN 106
5.3 COENZYM-BINDUNG UND ASSOZIATION DER APOENZYME
VON WILDTYP-ENZYM UND PUNKTMUTANTEN 110
5.3.1 BINDUNG DER COENZYME, FAD UND TPP 110
5.3.2 ASSOZIATIONSZUSTAND DER APOENZYME VON
WILDTYP UND PUNKTMUTANTEN 112
5.4 DISKUSSION 116
C. KRISTALLISATION DER PYRUVAT-OXIDASE AUS
LACTOBACILLUS PLANTARUM
6. KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN : 120
IV. ZUSAMMENFASSUNG 124
V. LITERATURVERZEICHNIS 127 |
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