Untersuchungen über das Kristallprotein, eine Serinesterase aus Dictyostelium discoideum:
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1992
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INHALTSVERZEICHNIS
I. ZUSAMMENFASSUNG 1
II. EINLEITUNG 3
III. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 7
1.
UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION UND AKTIVITAET DES KRISTALLPROTEINS 7
1.1. HOMOLOGE UEBEREXPRESSION DES KRISTALLPROTEIN-GENS 7
1.1.1. IDENTIFIKATION DER TRANSFORMANTEN UND GENOMANALYSE 8
1.1.2. ANALYSE DURCH WESTEM-BLOTS UND IMMUNFLUORESZENZ 9
1-2. AUSSCHALTUNG DES KRISTALLPROTEINS DURCH GENDISRUPTION 11
1.2.1. VEKTORKONSTRUKTION 12
1.2.2. IDENTIFIKATION DER TRANSFORMANTEN UND GENOMANALYSE 13
1-2.3. ANALYSE DER TRANSFORM ANTE IN NORTHERN- UND WESTEM-BLOTS 15
1.3. AUSWIRKUNGEN FAELLENDER ODER VERSTAERKTER KRISTALLPROTEINEXPRESSION
AUF DIE
ENTWICKLUNG
18
1.4. VERSUCHE ZUR FUNKTION UND LOKALISATION DES KRISTALLPROTEINS BEI DER
SPORENKEIMUNG 19
1.4.1. QUANTITATIVE AUSWIRKUNGEN ERHOEHTER ODER FEHLENDER EXPRESSION DES
KRISTALLPROTEINS
AUF DIE SPOREIKEIMUNG
19
1.4.2. LOKALISATION DES KRISTALLPROTEINS WAEHREND DER SPORENKEIMUNG 20
1.5. CHARAKTERISIERUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET DES KRISTALLPROTEINS
22
1.5.1. REINIGUNG DES ZUR ENZYMATISCHEN ANALYSE VERWENDETEN
KRISTALLPROTEINS 23
1.5.2. ERMITTLUNG DER SUBSTRATSPEZIFITAET FUER UNTERSCHIEDLICH LANGE
CARBONSAEURERESTE VON 4-
METHYLUMBELLIFERYLCARBONSAEUREESTEM 24
1.5.3. ERMITTLUNG DER OPTIMALEN SALZKONZENTRATION MIT KALIUMPHOSPHAT UND
DES
PH-OPTIMUMS 25
1.5.4. ERMITTLUNG VON UND V
MAX FUER 4-METHYLUMBELLIFERYLHEPTANOAT 26
1.5.5. ENZYMATISCHE AKTIVITAETEN MIT NATUERLICHEN SUBSTRATEN 27
1.6. DISKUSSION 28
1.6.1. UEBEREXPRESSION UND INAKTIVIERUNG DES KRISTALLPROTEIN-GENS 28
1.6.2. AKTIVITAET UND FUNKTION DES KRISTALLPROTEINS 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2. UNTERSUCHUNGEN ZUM TRANSPORT DES KRISTALLPROTEINS 32
2.1. DER AUSTAUSCH DER SIGNALSEQUENZ HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION 34
2.2. DIE DELETION EINES N-TERMINALEN, BASISCHEN PEPTIDS FUEHRT ZUR
SEKRETION DES VERKUERZTEN
KRISTALLPROTEINS 36
2.3. DIE FUSION EINES N-TERMINALEN KRISTALLPROTEINPEPTIDS MIT DEM
N-TERMINUS DES REIFEN,
C-TERMINAL VERKUERZTEN CSA-PROTEINS FUEHRT NICHT ZU EINEM TRANSPORT DES
FUSIONS
PROTEINS IN DIE KRISTALLVESIKEL, SONDERN ZU DESSEN SEKRETION 38
2.4. EIN C-TERMINAL VERKUERZTES KRISTALLPROTEIN WIRD, UNABHAENGIG VON DEM
N-TERMINALEN
BASISCHEN PEPTID, WEDER SEZEMIERT NOCH IN DIE KRISTALLVESIKEL
TRANSPORTIERT 40
2.5. ANALYSE DER MIT DEN ESTEROSOMEN COFRAKTIONIERENDEN MRNA 43
2.6. DISKUSSION 47
3. KRISTALLISATION DES KRISTALLPROTEINS 49
3.1. AUFREINIGUNG DES SEZEMIERTEN, AM N-TERMINUS UM NEUN AMINOSAEUREN
VERKUERZTEN
KRISTALLPROTEINS 49
3.2. KRISTALLISARIONSVERSUCHE MIT DEM SEZEMIERTEN, VERKUERZTEN
KRISTALLPROTEIN UNTER
HOCHSALZ-BEDINGUNGEN IM HAENGENDEN TROPFEN 50
3.3. KRISTALLISATION DES VOLLSTAENDIGEN PROTEINS UNTER
NIEDRIGSALZ-BEDINGUNGEN IM
HAENGENDEN TROPFEN 51
IV. MATERIAL UND METHODEN 55
1. MATERIAL 55
1.1. ENZYME, SUBSTRATE, ANTIKOERPER, INHIBITOREN UND ANTIBIOTIKA 55
12.
REAGENZIEN 57
1.3. MEDIEN 59
1.3.1. MEDIEN FUER DIE D. DISCOIDEUM-KULTUR 59
1.3.2. MEDIEN FUER DIE
K CO//-KULTUR 59
1.4. PUFFER UND ANDERE LOESUNGEN 60
1.5. BAKTERIENSTAEMME 61
1.6.
D. DISCOIDEUM-STAEMME 61
1.7. VEKTOREN 62
1.8. RADIOCHEMIKALIEN 62
1.9. GERAETE 62
1.10. SONSTIGE MATERIALIEN 64
2. KULTUR VON
D. DISCOIDEUM 65
2.1. ANZUCHT IN FLUESSIGMEDIUM 65
2.2. ANZUCHT AUF AGAIPLATTEN 65
2.3. SPORENGEWINNUNG UND KONSERVIERUNG 65
2.4. ENTWICKLUNG VON
D. DISCOIDEUM IN SUSPENSIONSKULTUR 66
2.5. ENTWICKLUNG VON
D. DISCOIDEUM AUF PHOSPHATAGARPLATTEN 66
3. PROTEINCHEMISCHE, IMMUNOLOGISCHE UND ENZYMATISCHE METHODEN 66
3.1. REINIGUNG VON PROTEINKRISTALLEN AUS
D. DISCOIDEUM 66
3.2. REINIGUNG VON ESTEROSOMEN AUS
D. DISCOIDEUM UND ABTRENNUNG ANHAFTENDER
RIBOSOMEN 67
3.3. TRENNUNG VON KRISTALLPROTEIN UND D2-PROTEIN DURCH HYDROXYAPATIT-
SAEULENCHROMATOGRAPHIE 68
3.4. REINIGUNG VON DCPA5' 69
3.5. REINIGUNG VON IGG AUS HYBRIDOMAKULTURUEBERSTAENDEN 69
3.6. SDS-PAGE UND" WESTEM" -TRANSFER 70
3.7. IMMUNMARKIERUNG 71
3.8. COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG VON PROTEINEN 71
3.9. PROTEINBESTIMMUNG 71
3.10. ENZYMATISCHE ANALYSEN 72
4. MIKROSKOPISCHE UND KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN 73
4.1. INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 73
42.
PRAEPARATION FUER DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE 74
4.3. KRISTALLISATION DURCH DAMPFDIFFUSION 75
5. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 76
5.1. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 76
5.1.1. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS
K COLI NACH HOLMES UND QUIGLEY 76
5.1.2. ISOLATION VON PLASMID-DNA MIT DER QUIAGEN-METHODE
TI
5.2. PRAEPARATION CHROMOSOMALER DNA AUS
D. DISCOIDEUM 78
5.3. VERDAU MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 79
5.4. DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 79
5.5. SOUTHEM-BLOT 79
5.6. DNA-FRAGMENTISOLIERUNG 80
5.6.1. FRAGMENTISOLIERUNG AUS DNA-GELEN MIT DE-81 IONENAUSTAUSCHPAPIER
80
5.6.2. FRAGMENTISOLIERUNG MIT "GLASMILCH" 81
5.7. RADIOAKTIVE MAIKIERUNG VON DNA-PROBEN DURCH "NICK-TRANSLATION" 81
5.8. HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN PROBEN 82
5.9. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS
D. DISCOIDEUM 83
5.10. RNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 84
5.11. NORTHEM-BLOT 84
5.12. KOLONIEN-PROTEIN-BLOT VON D. DISCOIDEUM 85
5.13. PHOSPHATASE-BEHANDLUNG 85
5.14. UEBERFUEHRUNG UEBERSTEHENDER ENDEN IN GLATTE ENDEN 85
5.15. DNA-LIGASE-REAKTION 87
5.16. TRANSFORMATION VON
KCOTI 87
5.16.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN NACH DER CAC^-METHODE 87
5.16.2. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN NACH DER MEHR-IONEN-TECHNIK 88
5.16.3. TRANSFORMATION 88
5.17. KOLONIEN-DNA-BLOT FUER
K COLI 89
5.18.
K COLI DAUERKULTUREN 89
5.19. TRANSFORMATION VON D. DISCOIDEUM 90
5.20. OLIGONUKLEOTIDE
5.21. "POLYMERASE-CHAIN''-REAKTION 93
5.22. EXPRESSION VON CDNA-FRAGMENTEN IN
D. DISCOIDEUM 94
5.22.1. UEBEREXPRESSION DES KRISTALLPROTEINS 94
5.22.2. EXPRESSION VON CK, EINEM KRISTALLPROTEIN MIT DER CSA
SIGNALSEQUENZ 95
5.22.3. EXPRESSION VON CKA5', EINEM KRISTALLPROTEIN MIT DER CSA
SIGNALSEQUENZ, DESSEN
BASISCHER KRISTALLPROTEIN-N-TERMINUS DELETIERT IST 96
522.4. EXPRESSION VON KC, EINEM C-TERMINAL VERKUERZTEN CSA-PROTEIN,
DESSEN SIGNALSEQUENZ
DURCH DEN N-TERMINUS DES KRISTALLPROTEINS AUSGETAUSCHT WURDE 96
5.22.5. EXPRESSION DER C-TERMINAL VERKUERZTEN KRISTALLPROTEINE KA3' UND
CKA51 A3' 96
523. KONSTRUIERTE PLASMIDE 97
524. PLASMID-DNA-SEQUENZIERUNG NACH DER KETTENABBRUCH-METHODE 98
5.25. COMPUTERPROGRAMME FUER DIE SEQUENZANALYSE UND DATENDARSTELLUNG 100
V. LITERATURVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
107
DANKSAGUNGEN
110 |
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