Ursachen der Resistenz des Gram-negativen Bakteriums Serratia marcescens gegen Beta-Laktam-Antibiotika: Defekte in ampD-vermittelter Beta-Laktamase Regulation und in Porinen der äußeren Membran
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0 URSACHEN DER RESISTENZ DES GRAM-NEGATIVEN BAKTERIUMS SERRATIA
MARCESCENS GEGEN SS-LAKTAM-ANTIBIOTIKA. - DEFEKTE IN AMPD-VENNITTELTER
SS-LAKTAMASE REGULATION UND IN PORINEN DER AEUSSEREN MEMBRAN - VON DEM
FACHBEREICH BIOLOGIE DER TECHNISCHEN HOCHSCHULE DARMSTADT ZUR ERLANGUNG
DES AKADEMISCHEN GRADES EINES DOCTOR RERUM NATURALIUM (DR.RER.NAT.)
GENEHMIGTE DISSERTATION EINGEREICHT VON APOTHEKER HERBERT WEINDORF AUS
FRANKFURT/M BERICHTERSTATTER: PROF. DR. H. H. MARTIN
MITBERICHTERSTATTER: PROF. DR. P. DANCKER TAG DER EINREICHUNG:
15.OKT.1991 TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 13.DEZ.1991 DARMSTADT 1991 - D
17 - I N H A L T S V E R Z E I C H N I S SEITE ABKUERZUNGSVERZEICHNIS A.
EINLEITUNG 1 B. MATERIAL UND METHODEN 25 1 . ORGANISMEN UND PLASMIDE 25
1.1. SERRATIA MARCESCENS 921/79 1.1.1. S. MARCESCENS 921/79 HR 1.1.2. S.
MARCESCENS 921/79 LR 1.2. S. MARCESCENS HIM 307-2 1.3. S. MARCESCENS CCM
303 1.4. ESCHERICHIA COLI K12 1.5. ESCHERICHIA COLI SH03, SN0301, SOWIE
E. COLI SN0302 1.6. PLASMIDE 26 2. NAEHRMEDIEN UND AUFBEWAHRUNG DER
ORGANISMEN 27 2.1. LB-MEDIUM 2.2. MUELLER-HINTON-BOUILLON 2.3.
M9CA-MEDIUM 2.4. NAEHRBOUILLON NACH PENASSAY 28 2.5. KONSERVIERUNG DER
BAKTERIEN 29 2.6. IDENTIFIZIERUNG DER BAKTERIEN 29 3. ANTIBIOTIKA 29 TI
TT 4. BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMM-KONZENTRATION 30 (MHK) EINES
ANTIBIOTIKUMS 4.1. DURCHFUEHRUNG DER BAKTERIZIDIE-KINETIK DURCH 30
BESTIMMUNG DER KOMBINATIONSWIRKUNG MIT MECIL- LINAM 5. DARSTELLUNG UND
BESTIMMUNG DER PROTEINE DER 31 AEUSSEREN MEMBRAN VON ENTEROBAKTERIEN 5.1.
PRAEPARATION DER AEUSSEREN MEMBRAN VON 31 ENTEROBAKTERIEN 5.2.
PROTEINBESTIMMUNG NACH MARKWELL 32 SEITE 5.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 32 5.3.1. BEREITUNG DER SDS GELE 33
5.3.2. PROBENVORBEREITUNG, PROBENAUFTRAG- UND LAUF- 34 BEDINGUNGEN
5.3.3. FAERBEN DER GELE 36 5.4. TRYPSINBEHANDLUNG ZUR SELEKTIVEN
VERDAUUNG 37 VON OMPA 5.5. MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 37
5.6. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER GELBANDEN 38 5.7. UNTERSUCHUNGEN AUF
PORINEIGENSCHAFTEN VON 38 PROTEINEN DER AEUSSEREN MEMBRAN VON ENTEROBAK-
TERIEN DURCH EINBAU IN LIPID-BILAYER-MEMBRANE NACH BENZ ET AL. 6.
PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 39 6.1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUM
NACHWEIS UND ZUR QUANTIFIZIERUNG VON PLASMID-DNA 6.2. PLASMIDPRAEPARATION
IN GROESSEREM ANSATZ 40 6.3. PLASMIDPRAEPARATION NACH BIRNBOIM 42
(MINIPRAEPARAT ION) 7. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA MIT DER 44
CALCIUMCHLORID METHODE 8. AKTIVITAETSBESTIMMUNG DER SS-LAKTAMASE 45 8.1.
KULTIVIERUNG VON BAKTERIENZELLEN IN 45 FLUESSIGMEDIUM UND HERSTELLUNG DER
ROHEXTRAKTE 8.2. INDUKTION DER SS-LAKTAMASE 46 8.3. PHOTOMETRISCHE
MESSUNG DER SS-LAKTAMASE- 46 AKTIVITAET 8.4. PROTEINBESTIMMUNG DES
S-LAKTAMASE 47 ROHEXTRAKTES SEITE C. ERGEBNISSE 48 1. GEWINNUNG DER
SERRATIA MARCESCENS STAEMME MIT 48 UNTERSCHIEDLICHEN RESISTENZSTUFEN
GEGENUEBER VERSCHIEDENEN ANTIBIOTIKA 1.1. REPRODUKTION DER IN VITRO
UEBERFUEHRBARKEIT VON 48 S. MARCESCENS 921/79 IN VERSCHIEDENE RESISTENZ-
STUFEN 1.2. GEWINNUNG EINER ISOGENEN REIHE VERSCHIEDENER 50
RESISTENZSTUFEN VON SERRATIA MARCESCENS DURCH KULTUR IN
CEFOTAXIM-HALTIGEM MEDIUM 2. MHK-WERTE UNTERSCHIEDLICHER ANTIBIOTIKA FUER
52 VERSCHIEDENE STAEMME VON SERRATIA MARCESCENS 3. PRUEFUNG AUF PLASMIDE
56 4. UEBERPRODUKTION VON SS-LAKTAMASE IN HR- UND LR 57 STAEMMEN VON S.
MARCESCENS 4.1. REVERSION VON SS-LAKTAMASE UEBERPRODUKTION 58 DURCH
KOMPLEMENTATION MIT AMPD + IN S. MAR- CESCENS HR UND LR 4.2.
TRANSFORMATION DES REKOMBINIERTEN PLASMIDES 58 PNU434 4.3.
SS-LAKTAMASE-AKTIVITAET VERSCHIEDENER STAEMME UND 60 TRANSFORMANTEN VON
SERRATIA MARCESCENS 4.4. UNTERSUCHUNGEN ZUR UEBERPRUEFUNG DES INTAKTEN 61
ZUSTANDES VON PNU434 (AMPD + , KANA R ) 4.5. VERLUST DER RESISTENZ GEGEN
SS-LAKTAM-ANTI- 64 BIOTIKA DURCH KOMPLEMENTATION MIT AMPD* IN
PNU434-TRANSFORMANTEN VON S. MARCESCENS HR UND LR SEITE 5.
KOLONIEMORPHOLOGIE UND GENERATIONSZEITEN VON 65 S. MARCESCENS HR UND LR
6. UNTERSUCHUNG DER PROTEINE DER AEUSSEREN MEMBRAN 66 (O.M. PROTEINE) VON
S. MARCESCENS HR, LR UND S ALS MOEGLICHE URSACHE FUER EINE
PENETRATIONSBAR- RIERE DER AEUSSEREN MEMBRAN 6.1. IDENTIFIZIERUNG VON
PORINEN 66 6.2. BESTIMMUNG DER PROTEINE DER AEUSSEREN MEMBRAN 74 6.3.
UNTERSUCHUNGEN ZU PORINEIGENSCHAFTEN DER 42 - 81 UND 40 KDA PROTEINE DER
AEUSSEREN MEMBRAN VON S. MARCESCENS 921/79 LR 6.4. QUANTITATIVE BESTIMMUNG
DER PORINE 84 VON S. MARCESCENS HIM 307-2 7. BAKTERIZIDIEKINETIK
SYNERGISTISCH WIRKENDER 92 SS-LAKTAMANTIBIOTIKA IN KOMBINATION D.
DISKUSSION 95 E. ZUSAMMENFASSUNG 102 F. LITERATURVERZEICHNIS 105 |
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