Enzymatische Untersuchungen zur Umwandlung von Flavinmononukleotid in den Basenteil von Vitamin B 12 bei Propionibacterium Shermanii:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGEN
3BITE
i_:________EINLEITUNG 1
2_.________MATERIAL UND MKTHODKN 10
Z.l.______REAGENTIKN UND LOSUNGEN 10
2.1.1. Fließmittel 10
2.1.2. Pufferlösungen 10
2.1.3. Inkubationszusätze 11
2.1.4. Herstellung einer 2-14C-DBI-Lösung,
Bestimmung der spezifischen Radioaktivität 12
2.1.5. Reinigung der Aktivkohle 12
2.1.6. Sprühreagenz zua Nachweis von Hydantoinaäure 12
2.2.______PHYSIKALISCHE METHODEN 13
2.2.1 Hochdruckflfissigkeitschroaatographie 13
2.2.2. Spektralphotoaetrie 13
2.2.3. Zentrifugationen 14
2.2.4. Dünnschicht-, Papier- und Säulenchromatographie 15
2.2.5. Am«oniu«sulfatfallung 15
2.2.6. Dialyse 16
2.2.7. Messung der Radioaktivität 16
2.3.______ISOLIBBUHC VOM 1 -»«C-RIBOFLAVIN-5 -MOHO-
PHO3PHAT AUS KIMM GKMI3CH UIUBIISCH
PHOSPHOBTLIKBTEN BIBOPLAVIHS MITTELS
2.4. 3Yirrmg8Bi 1»
2.4.1. Synthese von Riboflavin-Analogen alt
veränderter Seitenkette:
L(+)-Lyxoflavin, 2*-Deoxyriboflavin 19
3 -Deoxyriboflavln, D-Krythroflavin 19
-ii-
SBITB
2.4.2. Synthese von 4a-(n-Propyl)-4a,5-dihydroriboflavin 21
2.4.3. Phosphorylierung von Riboflavin-Analogen
Synthese von: 24
a) 2*-Deoxyriboflavin-5 -monopohosphat 24
b) 3 -Deoxyriboflavin-5 -monophosphat 24
c) L(+)-Lyxoflavin-5*-monophosphat 24
d) D-Erythroflavin-4 -monophosphat 24
e) 4a-(n-Propyl)-4a,5-dihydroriboflavin-5 -mono-
phosphat 24
f) 1-Deazariboflavin-5 -monophosphat 24
2.5.______MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 25
2.5.1. Konservierung von Propionibacterium shermanii,
Nährmedien 25
2.5.2. Anzucht und Fermentation von Propionibacterium
sheraanii 25
2.6.______HERSTELLUNG VON HOHOGBHATEN UND MODIFIZIERTEN HOMO-
GKNATKN VON PROPIONIBACTEHIUM SBSRMANII ST. 33 27
2.6.1. Herstellung des Homogenats 27
2.6.2. Trennung von Homogenat in Sediment und Überstand 27
2.6.3. Herstellung von gewaschenen Sediment 28
2.6.4. Herstellung von hitzebehandeltem Homogenat 28
2.6.5. Herstellung von hitzedenaturiertem,
entproteiniertem Rohextrakt 28
2.6.6. Herstellung von dialysiertem Rohextrakt 28
2.6.7. Herstellung von Ammoniumsulfat-Fraktionen 28
2.6.8. Inkubation des Sediments ait Lysozya 29
2.6.9. Herstellung von Aktivkohle-behandelte« Rohextrakt 29
2.7._______INKUBATIONEN 29
2.7.1. Inkubationen im 2 al-Maßstab mit
l -««C-Riboflavin-5 -phosphat 29
2.7.2. Inkubationen im 9 ml-Maßstab mit unmarkierten
Substraten bzw. mit unmarkierten
Strukturanalogen der Substrate 3
SEITE
2.7.3. Inkubationen mit 2-1*C-Riboflavin 31
2.8.______ANALYTISCHE METHODEN 31
2.8.1. Aufarbeitung der 2 ml-Anaätze mit
1 -» *C-Riboflavin-5 -phosphat:
Bestimmung der 5,6-Dimethylbenzimidazol-
Konzentration in den Binzelanaätzen 31
2.8.2. Aufarbeitung der 9 ml-Ansätze mit unmarkierten
Substraten bzw. Bit unmarkierten Strukturanalogen
der Substrate: Bestimmung der 5,6-Dimethylbenz-
iaidazol-Konzentration in den Einzelansätzen 32
2.8.3. Aufarbeitung der 75 ml-Ansätze mit
2-»«C-Riboflavin 33
2.8.4. Bestimmung von COi durch Flüssigkeits-
szintillationsspektrometrie 34
2.8.5. Enzymatische Bestimmung von D-Glycerinaldehyd-
3-phosphat und von Dihydroxyacetonphosphat 35
2.8.6. Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 35
3.________ERGEBNISSE 36
3.1. INKUBATION VOM RIBOFLAVIN-AMALOGEN MIT VERÄNDERTER
SEITENKKTTB TOTO VON DKRKN S -PHOSPHATKN 36
3.1.1. Inkubation von 2 -Deoxyriboflavin 37
3.1.2. Inkubation von 2 -Deoxyriboflavin-5 -monophosphat 39
3.1.3. Inkubation von 3 -Deoxyriboflavin 40
3.1.4. Inkubation von 3 -Deoxyriboflavin-5 -monophosphat 41
3.1.5. Inkubation von L +)-Lyxoflavin 42
3.1.6. Inkubation von L(+)-Lyxoflavin-5 -monophosphat 43
3.1.7. Inkubation von D-Erythroflavin 45
3.1.8. Inkubation von D-Erythroflavin-4 -monophoaphat 46
3.1.9. Enzymatische Bestimmung von D-Glycerinaldehyd-
3-phosphat und von Dihydroxyacetonphosphat 47
3.2._______INKUBATION VON RIBOFLAVIN-ANALOGEN MIT VERÄNDERTEM
RING C UND VON DEREN 5 -PHOSPHATEN 49
3.2.1. Inkubation von 1-Deazariboflavin 50
3.2.2. Inkubation von 1-Deazariboflavin-5 -nonophosphat 51
3.2.3. Inkubation von 4a-(n-Propyl)-4a,5-dihydro-
riboflavin 52
3.2.4. Inkubation von 4a-(n-Propyl)-4a,5-dihydro-
riboflavin-5 -monophosphat 54
3.3.______ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNGEN MIT 2-*«C-BIBO-
FLAVIN ALS SUBSTRAT 56
3.3.1. Hydantoinsäure, ein Metabolit aus dem Ring C
des Riboflavin-5 -phosphata? 56
3.3.2. Alkalische Hydrolyse des aus 2-»*C-Riboflavin
gebildeten Hydantoins zur Bestimmung der
Lokalisation von l*C 59
3.4.______UNTERSUCHUNGEN ZUR IDENTIFIZIERUNG. ZUR
ISOLIERUNG UND ZU DEN EIGENSCHAFTEN DER
DBI-SYNTHASE 60
3.4.1. Inkubationen im 2 ml-Maßstab mit
1 -» *C-Riboflavin-5 -monophosphat 61
3.4.2. Lokaliaation der DBI-Synthase 63
3.4.3. Ablösung des Membran-ständigen Faktors
von der Zellwand 64
3.4.4. Weitere Eigenschaften des DBI-bildenden
Enzymsystems 65
3.4.4.1. Verwendung von KCN zur Hemmung NADH-abhängiger
Reaktionen 65
3.4.4.2. Einsatz von NaBH, 66
3.4.4.3. Einsatz von p-Chlormercuribenzoat 68
3.4.5. Stabilisierung der DBI-Synthase,
Suche nach Cofaktoren 69
3.4.6. Versuche zur Anreicherung des im Rohextrakt
enthaltenen DBI-bildenden Enzyaaystems,
Einfluß von Glycerol auf modifizierte Ansätze 75
SEITE
4._____DISKUSSION 79
4.1. Zum Problem der aus dem Ribitylteil des
Riboflavin-5 -phosphats bei der Biosynthese von
5,6-Dimethylbenzimidazol entstehenden Bruchstücke 79
4.2. Inkubation mit 1-Deazariboflavin-5 -phosphat 82
4.3. Metaboliten aus dem Ring C des
Riboflavin-5 -phosphats bei der
Biosynthese von 5,6-Dimethylbenzimidazol 83
4.4. Isolierung von 1 -1 »C-Riboflavin-5 -phosphat
aus einem Gemisch verschiedener Phosphorsäure-
ester des l -1«C-Riboflavins, Entwicklung
einer neuen Inkubations- und Aufarbeitungsmethode 85
4.5. Ablösung des Membran-ständigen Faktors
von der Zellwand 86
4.6. Verschiedene Eigenschaften des
DBI-bildenden Enzymsystems 88
4.7. Anreicherung des DBI-bildenden Enzymsystems
aus dem Rohextrakt von Propionibacterium
shermanii, Beteiligung von Cofaktoren 90
4.8. Hypothetischer Reaktionsmechanismus der
Biosynthese von 5,6-Dimethylbenzimidazol
aus Riboflavin-5 -phosphat 93
5. ZU8AMHKNFAS8SUHG 95
LITEEATURVKBZSICHNIS 101
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