Vergleichende Differenzierung von Clostridium spp. mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATUR 2
2.1 PATHOGENE CLOSTRIDIEN - TAXONOMIE UND EIGENSCHAFTEN 2
2.1.1 TAXONOMIE 4
2.1.2 ALLGEMEINE EIGENSCHAFTEN 5
2.1.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA 6
2.1.4 PATHOGENITAETSMECHANISMEN 7
2.1.4.1 CLOSTRIDIUM BOTULINUM- NEUROTOXINE (BONT) 9
2.1.4.2 ENTEROTOXISCHER WIRKMECHANISMUS BEI C. PERFRINGENS 10
2.1.4.3 C. PERFRINGENS A-TOXIN 12
2.1.4.4 ENTEROTOXISCHER WIRKMECHANISMUS BEI C. DIFFICILE 12
2.1.4.5 HISTOTOXISCHER WIRKMECHANISMUS BEI C. NOVYI UND C.
HAEMOLYTICUM.. 13
2.1.4.6 HISTOTOXISCHER WIRKMECHANISMUS BEI C. CHAUVOEI UND C.
SEPTICUM... 14
2.2 CLOSTRIDIOSEN - VORKOMMEN UND BEDEUTUNG FUER MENSCH UND TIER 15
2.2.1 C. PERFRINGENS 15
2.2.2 C. BOTULINUM 19
2.2.3 C. DIFFICILE 25
2.2.4 C. CHAUVOEI. 27
2.2.5 C. SEPTICUM 28
2.2.6 C. NOVYI 30
2.2.7 C. HAEMOLYTICUM 31
2.3 DIAGNOSTIK DER CLOSTRIDIUM SPP 33
2.3.1 KLASSISCH-KULTURELLER NACHWEIS 33
2.3.2 BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG - MINIATURISIERTE TESTSYSTEME 34
2.3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN - REAL-TIME PCR 35
2.3.4 MALDI-TOF MS 37
3 MATERIAL UND METHODEN 3 9
3.1 MATERIAL 39
3.1.1 BAKTERIENSTAEMME 39
3.1.2 ARBEITSMATERIAL 39
3.2 METHODEN 40
3.2.1 KULTIVIERUNG DER CLOSTRIDIEN-STAEMME 40
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IMAGE 2
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.1 ALLGEMEINES VORGEHEN 40
3.2.1.2 ANPASSUNG DER FLUESSIGNAEHRMEDIEN 41
3.2.2 BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG 43
3.2.2.1 ALLGEMEINES VORGEHEN 43
3.2.2.2 AUSWERTUNG DER BIOCHEMISCHEN UNTERSUCHUNG 44
3.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS MITTELS REAL-TIME PCR 45
3.2.3.1 DNA-EXTRAKTION 45
3.2.3.2 REAL-TIME PCR - ALLGEMEINE VERFAHREN 45
3.2.3.3 REAL-TIME PCR ZUM NACHWEIS VON C. PERFRINGENS
NACH MESSELHAEUSSER ET AL. (2007A) 47
3.2.3.4 REAL-TIME PCR ZUM NACHWEIS VON C. BOTULINUM (MESSELHAEUSSER ET.
AL., 2007B UND IN-HOUSE VALIDIERTES NACHWEISVERFAHREN DES LGL) 52
3.2.3.5 REAL-TIME PCR ZUM NACHWEIS VON C. DIFFICILE, C. CHAUVOEI,
C. SEPTICUM UND C. HAEMOLYTICUM
(IN-HOUSE VALIDIERTES NACHWEISVERFAHREN DES LGL) 54
3.2.3.6 REAL-TIME PCR ZUM NACHWEIS VON C. NOVYI
(IN-HOUSE VALIDIERTES NACHWEISVERFAHREN DES LGL) 56
3.2.4 IDENTIFIZIERUNG MITTELS MALDI-TOF MS 57
3.2.4.1 VORBEREITUNG 57
3.2.4.2 PROBENAUFBEREITUNG 58
3.2.4.3 MESSUNG AM MALDI-TOF MS 59
3.2.4.4 AUSWERTUNG DER UNTERSUCHUNG MITTELS MALDI-TOF MS 59
4 ERGEBNISSE 6 1
4.1 BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG 61
4.1.1 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. PERFRINGENS 61
4.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. BOTULINUM 61
4.1.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. DIFFICILE UND C. SEPTICUM 63
4.1.4 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. CHAUVOEI, C. NOVYI UND
C. HAEMOLYTICUM 64
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS MITTELS REAL-TIME PCR 65
4.2.1 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. PERFRINGENS 65
4.2.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. BOTULINUM 66
4.2.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER UEBRIGEN CLOSTRIDIUM SPP 67
4.3 IDENTIFIZIERUNG MITTELS MALDI-TOF MS 68
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
4.3.1 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG VON C. BOTULINUM 68
4.3.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER UEBRIGEN CLOSTRIDIUM SPP 68
4.4 GEGENUEBERSTELLUNG DER IDENTIFIZIERUNGSERGEBNISSE DER BIOCHEMIE,
DER REAL-TIME PCR UND DER MALDI-TOF MS 69
4.4.1 GEGENUEBERSTELLUNG DER ERGEBNISSE VON C. PERFRINGENS 69
4.4.2 GEGENUEBERSTELLUNG DER ERGEBNISSE VON C. BOTULINUM 70
4.4.3 GEGENUEBERSTELLUNG DER ERGEBNISSE DER UNTERSUCHTEN CLOSTRIDIUM SPP
71
5 DISKUSSION 7 2
5.1 BEWERTUNG DER EINZELNEN UNTERSUCHUNGSVERFAHREN 73
5.1.1 PROBLEMATIK DER KULTIVIERUNG BEI EINZELNEN CLOSTRIDIUM SPP 73
5.1.2 BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG 74
5.1.3 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS MITTELS REAL-TIME PCR 76
5.1.4 IDENTIFIZIERUNG MITTELS MALDI-TOF MS 78
5.2 EMPFEHLUNG IM HINBLICK AUF DEN EINSATZ IN DER LEBENSMITTELANALYTIK
81
5.3 EMPFOHLENE VORGEHENSWEISE BEI EINER UNTERSUCHUNG AUF CLOSTRIDIUM
SPP.
IN DER LEBENSMITTELANALYTIK 83
6 ZUSAMMENFASSUNG 8 4
7 SUMMARY 8 6
8 LITERATURVERZEICHNIS 8 8
9 TABELLENVERZEICHNIS 1 0 2
1 0 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 1 0 4
11 ANHANG 1 0 5
11.1 NAEHRMEDIEN UND REAGENZIEN ZUR ANZUCHT 105
11.2 ARBEITSMATERIALIEN UND GERAETE 108
11.3 UEBERSICHTSTABELLEN UND ABBILDUNGEN ZU DEN UNTERSUCHUNGEN 113
11.4 VORGEHEN BEI EINER UNTERSUCHUNG AUF CLOSTRIDIUM SPP. IN DER
LEBENSMITTELANALYTIK 122
12 DANKSAGUNG 1 2 6
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