Untersuchungen des onkogenen Mechanismus des chimären Fusionsproteins MLL-ENL:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I.Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1. 11q23Translokationen 3
2.2. Funktion des Wildtyp-MLL 4
2.3. Translokationt(11;19) 6
2.4. Das induzierbare MLL-ENL(MLL-ENL-ER™) 7
3. Aufgabenstellung 8
4. Ergebnisse 9
4.1. MLL-ENL transformiert eine lymphoide/myeloide Zelle 10
4.1.1. Expression von MLL-ENL während der lymphoiden Entwicklung immortalisiert eine
B220*/CD19 Zelle 10
4.1.2. B220*/CD19 Zellen wachsen in syngenen Mäusen 14
4.2.3. MLL-ENL-exprimierende lymphoide/myeloide Zellen kombinieren Eigenschaften von
beiden hematopoietischen Linien 15
4.2. Transaktivierung ist der entscheidende Beitrag vom ENL-Anteil zur
Transformation durch MLL-ENL 17
4.2.1. Konstruktion „künstlicher MLL-Fusionsproteine 17
4.2.2. Das Transformierungspotential der „künstlichen MLL-Fusionsproteine 20
4.2.3. Das Transaktivierungspotential der „künstlichen MLL-Fusionsproteine 23
4.3. Charakterisierungen von MLL-ENL-ER™ transformierten Zellen und
Identifizierung der Zielgene von MLL-ENL 24
4.3.1. Charakterisierungen von MLL-ENL-ER™ transformierten Zellen 24
4.3.2. Identifizierung von MLL-ENL-ER™ Zielgenen 27
4.3.3. HOX und TALE Gene sind die für die Transformationsaktivität bedeutendsten Zielgene
des MLL-ENL 30
4.4. MLL-ENL-ER™ im Mausmodell 35
4.4.1. Charakterisierungen der MLL-ENL-ER™ transgenen Maus 35
4.4.2. Phänotypisierung der heterozygot MLL-ENL-ER™-transgenen Mäuse 37
4.4.3. Phänotypisierung der homozygot MLL-ENL-ER™-transgenen Mäuse 41
4.4.4. Ein Transplantationsmodell für MLL MLL-ENL-ER™-m_duzierte Leukämie 41
4.4.5. Modifiziertes Transplantationsmodell für MLL-ENL-ER -induzierte Leukämie 47
5. Diskussion 48
5.1. MLL-ENL transformiert eine lymphoide/myeloide Zelle 48
5.2. Transaktivierung ist der entscheidende Beitrag vom ENL-Anteil zur
Transformation durch MLL-ENL 50
5.3. Charakterisierungen von MLL-ENL-ER™ transformierten Zellen
und Identifizierung der Zielgene von MLL-ENL 52
5.4. MLL-ENL-ER™ im Mausmodell 55
6. Material und Methoden 58
6.1. Chemikalien 58
6.2. Puffer, Lösungen, und Standards 58
6.2.1. Allgemeine Puffer und Lösungen 58
6.2.2. Medien für Bakterien 59
6.2.3. Zellkulturmedien 59
6.2.4. Standards 60
6.2.4.1. DNA Standards 60
6.2.4.2. Protein Standards 61
6.3. Antikörper 61
6.3.1. Antikörper für Western-Blot Analysen 61
6.3.2. Antikörper für durchflußzytometrische Untersuchungen 61
6.4. Oligonukleotide 62
6.5. Plasmide 64
6.6. Allgemeine Methoden 66
6.7. Nukleinsäuremethoden 67
6.7.1. RNA Methoden 67
6.7.1.1. RNA-Isolierung 67
6.7.1.2. RT-PCR Analyse 67
6.7.1.3. Real-Time RT-PCR Analyse 68
6.7.1.4.Mikroarrayanalysen 69
6.7.2. DNA Methoden 69
6.7.2.1. DNA-Isolierung aus Gewebe für PCR Analysen 69
6.7.2.2. DNA-Isolierung aus Zellen für Southern-Blot und PCR Analysen 69
6.7.2.3. PCR Analyse 70
6.7.2.4. DNA Verdau für Southern-Blot Analyse 70
6.7.2.5. Herstellung und radioaktive Markierung der Sonden für Southern-Blot Analyse 71
6.7.2.6. Southern-Blot Analyse 72
6.8. Proteinmethoden 72
6.8.1. Herstellung nuklearer Proteinextrakte 72
6.8.2. Western-Blot Analyse 73
6.8.3. Antikörper-Färbung von (Oberflächen-) Markern 73
6.8.4. Durchflußzytometrie und Zellsortierung 74
6.9. Zellkulturmethoden 74
6.9.1. Transfektionsmethoden 74
6.9.1.1. Kalzium-Phosphat Transfektion 74
6.9.1.2. Fugene-6 Transfektion 74
6.9.1.3. Elektroporation 75
6.9.1.4. Retrovirale Transduktion 75
6.9.2. Knochenmarkpräparation 75
6.9.3. Knochenmark Koloniebildungsversuch 75
6.9.4. Zytospinpräparation 76
6.9.5. Luziferasetest 76
6.9.6. Wachstumsmessung 77
6.9.7. Retrovirenherstellung 77
6.10. Zelllinien 78
6.10.1. Suspensionszellen 78
6.10.2. Adhärente Zellen 78
6.11. Versuchstiere 78
6.11.1. Mause und Haltung 78
6.11.2. Konditionierung der Mäuse 78
6.11.2.1. Chemische Konditionierung mit Busulfan 78
6.11.2.2. Bestrahlung 79
6.11.3. Transplantation von Zellen in Empfängermäuse 79
6.11.3.1. Intraperitoneale Injektion 79
6.113.2. Intravenöse Injektion 80
7. Literaturverzeichnis 81
8. Anhang 89
8.1. Verzeichnis der Abbildungen 89
8.2. Verzeichnis der Abkürzungen 91
8.3. Publikationsliste 93
8.4. Lebenslauf 97
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