Die Bedeutung genetischer Variationen im Bereich des Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) Locus bei rheumatoider Arthritis (RA):
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2007
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis viii
1 Einleitung 1
1.1 Das Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) und seine Bedeutung innerhalb
der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HHN)-Achse 1
1.1.1 Vorkommen des CRH 1
1.1.2 Die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden (HHN)-Achse 1
1.1.3 Die HHN-Achse unter Stress 4
1.1.4 Der Insulin-Hypoglykämie-Test (IHT) 4
1.1.5 Die Regulation der CRH-Sekretion 5
1.2 Der CRH-Genlocus 5
1.2.1 Das CRH-Gen und seine 5 -regulatorische Region 5
1.2.2 Polymorphismen in der 5 -regulatorischen Region des CRH-Gens 8
1.2.3 In vitro Regulation des CRH-Gens anhand von Zellmodellen 9
1.3 Die rheumatoide Arthritis 11
1.3.1 Definition 11
1.3.2 Ätiologie 12
1.3.3 Pathogenese 12
1.3.4 Klinischer Verlauf 13
1.3.5 Therapie 14
1.4 Pathogenetische Bedeutung des neuroendokrinen Systems bei RA 14
1.5 Zielstellung 17
2 Material und Methoden 20
2.1 Materialien 20
2.1.1 Laborgeräte 20
2.1.2 Allgemeine Materialien, Chemikalien und Lösungen 22
2.1.3 Materialien, Chemikalien und Lösungen für zellbiologische Methoden 23
2.1.3.1 Allgemeine Materialien, Chemikalien und Lösungen 24
2.1.3.2 Regulatorische Substanzen 24
2.1.3.3 Rekombinante Proteine 25
2.1.4 Materialien, Chemikalien und Lösungen für proteinbiochemische Methoden 25
2.1.4.1 Allgemeine Materialien, Chemikalien und Lösungen 25
2.1.4.2 Sonden 28
Inhaltsverzeichnis v
2.1.5 Materialien, Chemikalien und Lösungen für molekularbiologische Methoden 29
2.1.5.1 Allgemeine Materialien, Chemikalien und Lösungen 29
2.1.5.2 Gele und Lösungen 31
2.1.5.3 Oligonukleotide (Primer) 33
2.1.5.4 Plasmide 36
2.1.6 Datenbanken und Software zur Analyse und Auswertung von Daten 36
2.2 Zellbiologische Methoden 39
2.2.1 Zelllinien 39
2.2.1.1 Kultivierung der Zelllinie PC 12 39
2.2.1.2 Kultivierung der Zelllinie AtT-20/D16vF2 39
2.2.2 Durchflusszytometrie 39
2.3 Proteinbiochemische Methoden 40
2.3.1 Zelllyse 40
2.3.1.1 Lyse zur Präparation von Kernproteinen 40
2.3.1.2 Proteinbestimmung nach Pierce (Bicinchoninic Acid, BCA) 41
2.3.2 Electrophoretic Mobility Shifi Assay (EMSA) zum Nachweis der 41
Translokation potentieller Transkriptionsfaktoren
2.3.2.1 Herstellung von radioaktiv markierten Oligonukleotid-Sonden 41
2.3.2.2 Bindungsreaktion 42
2.3.2.3 Nicht denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Nachweis der
radioaktiven Markierung 43
2.4 Molekularbiologische Methoden 44
2.4.1 DNA-Extraktion 44
2.4.1.1 Patienten 44
2.4.1.2 Kontrollgruppen 45
2.4.2 Polymerase-Kettenreaktion 45
2.4.3 Agarosegel-Elektrophorese 47
2.4.4 Quantitative DNA-Bestimmung 48
2.4.5 Restriktionsfragmentanalyse zur Genotypisierung 48
2.4.6 Herstellung von pGL3-5 CRH-LUC Luciferasegenkonstrukten mittels zweistufiger
Klonierungsstrategie 49
2.4.6.1 Long-Range PCR und Klonierung der PCR-Produkte 49
2.4.6.2 Isolierung des CRH-Promoterkonstrukts aus dem pCR2.1-CRH-Plasmid 49
2.4.6.3 Klonierung in das Reportersystem 50
2.4.6.4 Transformation der Ligationsprodukte 52
2.4.6.5 Transformation des Expressionsvektor EGFP-C1 54
2.4.7 Transiente Transfektion der Zelllinien AtT-20/Dl 6vF2 und PC 12 54
Inhaltsverzeichnis vj
2.4.7.1 Vorversuche mit dem EGFP-Plasmid 54
2.4.7.2 pGL3-Reportergensystem: Kontrolltransfektion 55
2.4.7.3 Beschichtung der Zellkulturplatten für die Transfektion 55
2.4.7.4 Transfektion der Zelllinie PC12 56
2.4.7.5 Transfektion der Zelllinie AtT-20 56
2.4.8 Luciferase-Reportergenassay 57
2.4.9 Sequenzierung 58
2.5 Untersuchung der HHN-Achse mittels Insulin-Hypoglykämie-Test (IHT) 60
2.5.1 Aufnahmekriterien der Studie 60
2.5.2 Durchführung des IHT 60
2.6 Statistische Auswertung 61
3 Ergebnisse 63
3.1 Ergebnisse zur Populationsgenetik 63
3.1.1 Patienten und Kontrollen 63
3.1.2 Analyse der CRH-Promoterpolymorphismen 63
3.2 Electrophoretic Mobility ShiftAssay (EMSA): Gelretardationsanalysen 72
3.2.1 Gelretardationsanalyse zur Untersuchung der spezifischen Erkennung von den
DNA-Fragmenten 5 ggccaccatgtaagacgtgtctttgcttctccatt 3 (Wildtyp) und
5 ggccaccatgtaagacgtgcctttgcttctccatt 3 (Mutante) durch nukleare Proteine 72
3.2.2 Gelretardationsanalyse zur Untersuchung der spezifischen Erkennung von den
DNA-Fragmenten 5 ggctcctttccagaagttattcttacatgtaagat 3 (Wildtyp) und
5 ggctcctttccagaagttagtcttacatgtaagat 3 (Mutante) durch nukleare Proteine 74
3.2.3 Gelretardationsanalyse zur Untersuchung der spezifischen Erkennung von den
DNA-Fragmenten 5 ggactgttgtgttggctctgttttaatttacc 3 (Wildtyp) und
5 ^ggactgttgtgttgggtctgttttaattta 3 (Mutante) durch nukleare Proteine 75
3.2.4 Gelretardationsanalyse zur Untersuchung der spezifischen Erkennung von den
DNA-Fragmenten 5 ^ggctgcattttgagagatttattggccttgcttc 3 (Wildtyp) und
5 ^ggctgcattttgagagacttattggccttgcttc 3 (Mutante) durch nukleare Proteine 76
3.3 Untersuchungen zur CRH-Promoteraktivität 78
3.3.1 Gentechnische Vorarbeiten und Vorversuche in der Zellkultur 78
3.3.1.1 Isolierung des CRH-Promoterkonstrukts aus dem TA-Vektor 78
3.3.1.2 Präparation des Reporter-Plasmids und Ligasereaktion 78
3.3.1.3 Transformation der Ligationsprodukte und anschließende
Plasmid-Präparation 80
3.3.1.4 Vorversuche für die Transfektion des Konstruktes in die Zelllinien
AtT-20 und PC 12 80
I nhaltsverzeichni s vii
3.3.2 Funktionelle Untersuchungen des CRH-Genlocus mittels Luciferasereportergenassay
in Abhängigkeit der CRH-Promoterpolymorphismen 82
3.3.2.1 Vorversuche mit dem pGL3-Reportergensystem 82
3.3.2.2 Der Einfluss von 8-Br-cAMP 88
3.3.2.3 Wirkungen derZytokine (IL-lß, IL-6, TNFa und IFNy) 88
3.3.2.4 Wirkungen der kombinierten Behandlung mit 8-Br-cAMP und den
Zytokinen (IL-1 ß, IL-6, TNFa und IFNy) 89
3.3.2.5 Wirkung von Dexamethason auf die 8-Br-cAMP stimulierte
5 -CRH-Promoteraktivität 90
3.3.2.6 Einfluss von Dexamethason in Ko-Inkubation mit Zytokinen bzw.
Zytokinen und 8-Br-cAMP 93
3.4 Insulin-Hypoglykämie-Test 94
3.4.1 IHT mit RA-Patienten 94
3.4.1.1 Typisierung der Patienten 94
3.4.1.2 Klinische Daten der RA-Patienten 95
3.4.1.3 Blutzucker 96
3.4.1.4 CRH 96
3.4.1.5 ACTH 97
3.4.1.6 Kortisol 98
3.4.2 IHT mit der gesunden Kontrollgruppe 100
3.4.2.1 Blutzucker 100
3.4.2.2 CRH 101
3.4.2.3 ACTH 102
3.4.2.4 Kortisol 103
4 Diskussion 105
4.1 Genetische Populationsstudien hinsichtlich der Prädisposition des
CRH-Genlocus in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA) 105
4.2 Gelretardationsanalysen und Promoterstudien 109
4.3 Insulin-Hypoglykämie-Test 122
5 Zusammenfassung 135
6 Literaturverzeichnis 140
Anhang
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