Synthetische Riboswitches zur Transkriptionskontrolle:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Elektronisch Software E-Book |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 6
1 EINLEITUNG 11
1.1 GENREGULATION DURCH RNA-SCHALTER: NATUERLICHE RIBOSWITCHES 11
1.1.1 ENTDECKUNG UND FUNKTIONSWEISE NATUERLICHER RIBOSWITCHES 11
1.1.2 KLASSEN NATUERLICHER RIBOSWITCHES 13
1.1.3 ARTEN DER GENREGULATION IN NATUERLICHEN RIBOSWITCHES 14
1.2 ARTIFIZIELLE RIBOSWITCHES 17
1.2.1 BEDEUTUNG UND SELEKTION ARTIFIZIELLER RIBOSWITCHES 17
1.2.2 ARTEN DER RIBOSWITCHSELEKTION 20
1.2.3 EINES FUER ALLE: DAS THEOPHYLLINAPTAMER 23
1.2.4 COMPUTERBASIERTE ANSAETZE ZUM DESIGN VON RNA-REGULATOREN 26
1.3 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 28
2 MATERIAL 29
2.1 WASSER 29
2.2 CHEMIKALIEN UND NATURSTOFFE 29
2.3 NUKLEOTIDE UND RADIONUKLEOTIDE 29
2.4 OLIGONUKLEOTIDE 29
2.5 ENZYME *. 32
2.6 ANTIBIOTIKA 32
2.7 PUFFER UND LOESUNGEN 32
2.7.1 ALLGEMEINE PUFFER 33
2.7.2 PUFFER FUER REPORTERGENASSAYS 34
2.7.3 PUFFER FUER METHODEN DER RNA-ANALYTIK 34
2.8 MIKROORGANISMEN 36
2.9 PLASMIDE 36
2.10 NAEHRMEDIEN 36
2.11 KITS 36
2.12 GERAETE 36
2.12.1 INKUBATOREN, HEIZBLOECKE UND MIXER 36
2.12.2 THERMOCYCLER 37
2.12.3 PHOTOMETER UND SPEKTROMETER 37
2.12.4 GELDOKUMENTATION 37
2.12.5 ZENTRIFUGEN UND ROTOREN 38
2.12.6 SONSTIGE GERAETE 38
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2.13 SOFTWARE 38
2.14 SONSTIGES 39
3 METHODEN 40
3.1 ALLGEMEINE NUKLEINSAEUREMETHODEN 40
3.1.1 BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 40
3.1.2 REINIGUNG UND FAELLUNG VON DNA UND RNA 40
3.1.3 PLASMIDEXTRAKTION AUS E. COLI 40
3.1.4 PRAEPARATION VON TOTAL-RNA 41
3.1.5 DNA-SEQUENZIERUNG 41
3.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 41
3.2.1 STANDARD-PCR 41
3.2.2 OVERLAP-EXTENSION PCR 42
3.2.3 MUTAGENESE-PCR 43
3.2.4 KOLONIE-PCR 44
3.3 RESTRIKTIONSENZYMATISCHER ABBAU 44
3.4 DNA-LIGATION 45
3.5 GELELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN 45
3.5.1 AUFTRENNUNG VON DNA ODER RNA MITTELS AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 45
3.5.2 AUFTRENNUNG VON DNA UND RNA MITTELS
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 46
3.6 ZELLMETHODEN 46
3.6.1 TRANSFORMATION 46
3.6.2 KULTIVIERUNG VON E. COLI-ZELLEN 46
3.7 REPORTERGENASSAYS 47
3.7.1 QUANTITATIVE ANALYSE DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET (ONPG-TEST) 47
3.7.2 ANALYSE DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET DURCH BLAU-WEISS-TEST
(X-GAL-TEST) 48
3.7.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER GFP-FLUORESZENZ 48
3.8 METHODEN DER RNA-ANALYTIK 49
3.8.1 5 -MARKIERUNG VON DNA-SONDEN FUER DOT BLOTS UND NORTHERN BLOTS 49
3.8.2 DOTBLOT 49
3.8.3 NORTHERN BLOT 50
3.8.4 IN V/YRO-TRANSKRIPTION ZUR DETEKTION VON PAUSE SITES 50
3.8.5 IN W FRO-TRANSKRIPTION MIT THEOPHYLLIN-GRADIENT 51
3.8.6 HERSTELLUNG EINES LAENGENSTANDARDS FUER IN W FRO-TRANSKRIPTIONEN 51
4 ERGEBNISSE 53
4.1 DIE IN SILICO-SELEKTION VON TRANSKRIPTIONSREGULIERENDEN RIBOSWITCHES
53
4.1.1 DESIGNPRINZIPIEN FUER DIE SELEKTION 53
4.1.2 BIOINFORMATISCHE SELEKTION VON THEOPHYLLINRIBOSWITCHES 55
4.2 REPORTERGENMESSUNGEN AN SYNTHETISCHEN RIBOSWITCHES 57
4.2.1 HERSTELLUNG VON RIBOSWITCH-REPORTERGENFUSIONEN 57
4.2.2 SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET VON KONSTRUKTEN MIT
THEOPHYLLINRIBOSWITCHES AUS DER
IN SILICO-SELEKTION 58
4.2.3 REGULATION DER GFP-EXPRESSION DURCH THEOPHYLLINRIBOSWITCH 10 60
4.2.4 EINFLUSS DER POSITION DES RIBOSWITCHES AUF DIE GENEXPRESSION 62
4.2.5 EINFLUSS VON MUTATIONEN IM LOOP DES TERMINATORS VON RIBOSWITCH 10
64
4.2.6 REPORTERGENREPRESSION DURCH SYNTHETISCHE TERMINATOREN 66
4.2.7 EINFLUSS DER DELETION DES TERMINATORS AUF DIE GENEXPRESSION 68
4.2.8 BETRACHTUNG DER SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET DURCH EINEN X-GAL-TEST 69
4.3 UNTERSUCHUNG DER MRNA-EXPRESSION IN DEN RIBOSWITCHKONSTRUKTEN 71
4.3.1 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTMENGEN VON RIBOSWITCH 10-KONSTRUKTEN
DURCH DOT
BLOTS 71
4.3.2 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTMENGEN DER TERMINATORKONSTRUKTE 72
4.3.3 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTMENGEN VON RIBOSWITCH 10-KONSTRUKTEN IN
ABHAENGIGKEIT VON THEOPHYLLIN 73
4.3.4 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTMENGE DER KONTROLLKONSTRUKTE 74
4.4 IN WFRO-UNTERSUCHUNGEN VON RIBOSWITCH 10 UND RIBOSWITCH 2 75
4.4.1 UNTERSUCHUNG DER IN W FRO-TRANSKRIPTION IN ECHTZEIT 75
4.4.2 NACHWEIS DER THEOPHYLLINBEDINGTEN TRANSKRIPTELONGATION IN VITRO 79
5 DISKUSSION 81
5.1 ERFOLG DER IN SILICO-SELEKTION UND VERGLEICH MIT ANDEREN METHODEN 81
5.2 HERAUSFORDERUNGEN BEI DER MESSUNG VON REPORTERGENAKTIVITAETEN 84
5.3 FUNKTIONSWEISE VON INTRINSISCHEN TERMINATOREN 86
5.4 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG UND ANSAETZE ZUR OPTIMIERUNG DER
THEOPHYLLINRIBOSWITCHES 89
5.5 UEBERTRAGUNG DER RNA-SCHALTER AUF ANDERE GENETISCHE SYSTEME 93
5.6 UEBERTRAGUNG DES DESIGNPRINZIPS AUF ANDERE APTAMERE 95
5.6.1 DAS STREPTOMYCINAPTAMER 96
5.6.2 ANDERE APTAMERE 98
5.7 UEBERTRAGUNG DES DESIGNPRINZIPS AUF TRANSKRIPTIONEILE OFF-SWITCHES 99
5.8 VERGLEICH ARTIFIZIELLER TRANSKRIPTIONSSWITCHES MIT
TRANSLATIONSSWITCHES 102
5.9 ANWENDUNGEN UND POTENTIAL ARTIFIZIELLER RIBOSWITCHES 104
6 AUSBLICK 107
7 LITERATURVERZEICHNIS 108
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