PaNie (Pythium aphanidermatum necrosis inducing elicitor): ein heterolog exprimierter Proteinelicitor als Auslöser multipler Abwehrreaktionen in Mono- und Dikotyledonen
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
RESISTENZMECHANISMEN
VON
PFLANZEN
GEGEN
PATHOGENE
1
1.1.1
PRAEFORMIERTE
ABWEHR
2
1.1.2
INDUZIERTE
ABWEHR
3
1.1.2.1
LONENFLUESSE
4
1.1.2.2
OXIDATIVE
BUERST
UND
STICKOXID-BURST
(NO
BUERST)
5
1.1.2.3
PROGRAMMIERTER
ZELLTOD
(PCD)
9
1.1.2.4
PR-GENE
UND
PHYTOALEXINBIOSYNTHESE
10
1.1.2.5
SYSTEMISCH
ERWORBENE
RESISTENZ
(SAR)
12
1.2
DAS
ELICITOR-REZEPTOR-MODELL
DER
PATHOGENERKENNUNG
IN
PFLANZEN
13
1.2.1
AVR-GENPRODUKTE
14
1.2.2
GENERELLE
EHCITOREN
18
1.2.3
STRUKTUR
UND
FUNKTION
PFLANZLICHER
R-GENPRODUKTE
21
1.2.4
ELICITOR-REZEPTOREN
24
1.3
RESISTENZ
GEGENUEBER
OOMYCETEN
27
1.4
ZIELE
DIESER
ARBEIT
29
2
MATERIAL
30
2.1
ABKUERZUNGEN
30
2.2
AMINOSAEUREN
31
2.3
VERWENDETE
ORGANISMEN
31
2.3.1
BAKTERIEN
31
2.3.2
HEFEN
32
2.3.3
PFLANZEN
32
2.3.4
OOMYCETEN
32
2.4
VEKTOREN
33
2.5
PCR
PRIMER
33
2.6
DNA-SONDEN
34
2.7
PUFFER
UND
LOESUNGEN
35
2.8
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
38
2.9
RESTRIKTIONSKARTEN
40
3
METHODEN
43
3.1
VERSUCHSOBJEKTE
43
3.1.1
DAUCUS
CAROTA
L.
43
3.1.1.1
KALLUSKULTUREN
43
3.1.1.2
SUSPENSIONSKULTUREN
43
3.1.1.3
PROTOPLASTEN
44
3.1.2
PYTHIUM
APHANIDERMATUM
(EDSON)
FITZP.
44
3.1.2.1
STANDKULTUREN
44
3.1.2.2
SUSPENSIONSKULTUREN
45
3.1.3
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
45
3.1.4
KULTIVIERUNG
VON
HEFEN
46
3.1.5
KULTIVIERUNG
DER
PFLANZEN
46
3.2
NUCLEINSAEUREN
47
3.2.1
ISOLIERUNG
DER
NUCLEINSAEUREN
47
3.2.1.1
GESAMT-RNA
ISOLIERUNG
47
3.2.1.1.1
VERMEIDUNG
DER
RNASE-AKTIVITAET
47
3.2.1.1.2
ISOLIERUNG
AUS
HEFEN
UND
BAKTERIEN
47
3.2.1.1.3
ISOLIERUNG
AUS
PYTHIUM
APHANIDERMATUM
48
3.2.1.1.4
ISOLIERUNG
AUS
ARABIDOPSISBLAETTERN
49
3.2.1.2
DNA-ISOLIERUNG
49
3.2.1.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
PYTHIUM
APHANIDERMATUM
49
3.2.1.2.2
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
BLAETTERN
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
50
3.2.1.2.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
PROTOPLASTEN
50
3.2.1.2.4
ISOLIERUNG
DER
PLASMID-DNA
51
3.2.2
FAELLUNG
DER
NUCLEINSAEUREN
52
3.2.2.1
FAELLUNG
MIT
ETHANOL
52
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.2
FAELLUNG
MIT
ISOPROPANOL
52
3.2.3
ERSTSTRANGSYNTHESE
53
3.2.4
SCHNEIDEN
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
53
3.2.5
DNA
AMPLIFIZIERUNG
MITTELS
PCR
53
3.2.6
BLUNTING
VON
EINZELSTRANGUEBERHAENGEN
54
3.2.7
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
55
3.2.7.1
NICHT-DENATURIERENDES
AGAROSEGEL
(DNA-AUFTRENNUNG)
55
3.2.7.1.1
PLASMIDE
UND
RESTRIKTIONSFRAGMENTE
UND
PCR-PRODUKTE
55
3.2.7.1.2
GENOMISCHE
DNA
56
3.2.7
2
DENATURIERENDES
AGAROSEGEL
(RNA-AUFTRENNUNG)
56
3.2.8
LANGENSTANDARDS
56
3.2.9
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
57
3.2.9.1
QUANTIFIZIERUNG
UEBER
SPEKTROMETRIE
57
3.2.9.2
FLUORESZENZINTENSITAET
MIT
ETHIDIUMBROMID
IM
GEL
57
3.2.10
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
57
3.2.11
NORTHERN-BLOT
58
3.2.11.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
58
3.2.11.2
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
FUER
NORTHERN-BLOTS
59
3.2.11.3
DETEKTION
59
3.2.12
DNA
SEQUENZIERUNG
60
3.3
KLONIERUNGSTECHNIKEN
61
3.3.1
HERSTELLUNGKOMPETENTERZELLEN
61
3.3.1.1
BAKTERIEN
61
3.3.1.2
HEFEN
61
3.3.2
LIGATION
62
3.3.2.1
BLUNT
END
LIGATION
IN
PZEROYY-1
62
3.3.2.2
STICKY
END
LIGATION
62
3.3.3
TRANSFORMATION
63
3.3.3.1
BAKTERIENTRANSFORMATION
63
3.3.3.2
HEFETRANSFORMATION
63
3.4
PROTEINE
64
3.4.1
PROTEINEXTRAKTION
64
3.4.1.1
PROTEINEXTRAKTION
AUS
SUSPENSIONSKULTUREN
64
3.4.1.2
PROTEINEXTRAKTION
AUS
HEFEN
64
3.4.1.2.1
EXTRAKTION
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
ZUR
WESTERN-BLOT-ANALYSE
65
3.4.1.2.2
EXTRAKTIONSMETHODE
ZUR
GEWINNUNG
NATIVER
PROTEINE
65
3.4.2
TEST
AUF
YYINCLUSION
BODIES
"
BEI
HETEROLOGER
EXPRESSION
IN
E.
COLI
(NACH
MANIATIS
17.37
FF.)
66
3.4.3
SDS-PAGE
67
3.4.4
WESTERNBLOTTING
(SEMI-DRY-METHODE)
67
3.4.5
FARBEMETHODEN
68
3.4.5.1
PROTEINFAERBUNG
IN
SDS-GELEN
68
3.4.S.2
PROTEINFAERBUNG
AUF
MEMBRANEN
MIT
PONCEAU
S
68
3.4.5.2.1
PONCEAU
S
FAERBUNG
68
3.4.5.2.2
IMMUNOFAERBUNG
69
3.4.6
PROTEINBESTIMMUNG
69
3.5
DER
ELICITOR
70
3.5.1
HERSTELLUNG
EINES
ELICITORAKTIVEN
ROHEXTRAKTES
AUS
PYTHIUM
APHANIDERMATUM
70
3.5.1.1
KONZENTRIERUNG
DURCH
ULTRAFILTRATION
70
3.5.2
PANIE2I3/234
70
3.5.2.1
5'-RACE
70
3.5.2.2
HETEROLOGE
EXPRESSION
72
3.5.2.3
HIS-TAG
REINIGUNG
BEI
HETEROLOGER
PANIE
2
I3-EXPRESSION
IN
ESCHERISCHIA
COLI
73
3.5.2.4
HIS-TAG
REINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
74
3.5.3
ELICITIERUNGSMETHODEN
74
3.5.3.1
ELICITIERUNG
VON
SUSPENSIONSKULTUREN
DER
KAROTTE
74
3.5.3.2
ELICITIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
75
3.5.S.3
ELICITORAPPLIKATION
BEI
INTAKTEN
PFLANZEN
75
3.5.3.3.1
ELICITORAPPLIKATION
UEBER
DEN
TRANSPIRATIONSSTROM
75
3.5.3.3.2
INFILTRATIONSMETHODE
75
INHALTSVERZEICHNIS
3.6
PHYSIOLOGISCHE
TESTS
76
3.6.1
PAL
ENZYM
TEST
76
3.6.2
ISOLIERUNG
UND
NACHWEIS
ZELLWANDGEBUNDENER
PHENOLE
77
3.6.2.1
NEUTRALZUCKERBESTIMMUNG
79
3.6.3
ETHYLENBESTIMMUNG
79
3.6.3.1
MESSBEDINGUNGEN
79
3.6.3.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
80
3.6.4
VITALITAETSBESTIMMUNG
MITTELS
TETRAZOLIUM-TEST
80
3.6.5
NACHWEIS
VON
KAILOSE
81
3.6.6
H
2
O
2
BESTIMMUNG
82
3.6.6.1
DAB-METHODE
82
3.6.6.2
OXYBURST
H
2
HFF
BSA
GREEN
ASSAY
82
4
ERGEBNISSE
86
4.1
WIRKUNG
DES
PROTEINELICITORS
AUS
PYTHIUM
APHANIDERMATUM
86
4.2
DER
GENETISCHE
CODE
VON
PANIE
234
88
4.3
DAS
PANIE
PROTEIN
90
4.4
GENOMISCHE
ORGANISATION
VON
PANIE
94
4.5
ANTISERUM
GEGEN
PANIE
96
4.6
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
PANIE
234
98
4.6.1
EXPRESSION
VON
PANIE
234
IM
PROKARYOTISCHEN
EXPRESSIONSSYSTEM
98
4.6.2
PANIE
234
-EXPRESSION
IM
EUKARYOTISCHEN
EXPRESSIONSSYSTEM
102
4.7
HETEROLOGE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
PANIE
213
IM
PROKARYOTISCHEN
SYSTEM
107
4.8
PHYSIOLOGISCHE
TESTS
MIT
PANIE
213
AM
KAROTTEN-SYSTEM
109
4.8.1
PANIE
213
-VERMITTELTE
4-HBA
AKKUMULATION
110
4.8.2
PANIE
2
I
3
-VERMITTELTER
VITALITAETSVERLUST
111
4.8.3
PANIE
213
-VERMITTELTE
FRAGMENTIERUNG
NUCLEAERER
DNA
113
4.9
DIE
WIRKUNG
VON
PANIE
213
AUF
INTAKTE
PFLANZEN
115
4.9.1
ELICITOR-VERMITTELTE
GEN-AKTIVIERUNG
115
4.9.2
KONZENTRATIONSABHAENGIGE
NEKROSENBILDUNG
BEI
ARABIDOPSIS
THALIANA
COL-0
116
4.9.3
DIFFERENTIELLE
WIRKUNG
VON
PANIE
213
AUF
MONO
UND
DIKOTYLEDONEN
119
4.9.4
PANIE
213
-VERMITTELTE
KALLOSEDEPOSITION
121
4.9.5
YYOXIDATIVE
BUERST
"
123
4.9.6
ETHYLEN
133
4.9.7
CAMALEXIN
135
5
DISKUSSION
137
5.1
DIE
UEBERTRAGUNG
DES
KAROTTEN-PYFH/UM-SYSTEMS
AUF
ARABIDOPSIS
THALIANA
137
5.2
PANIE,
EIN
REINER
PROTEINELICITOR
138
5.3
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
PANIE
141
5.4
PHYSIOLOGISCHE
TESTS
IM
KAROTTENSYSTEM
142
5.5
WIRKUNG
VON
PANIE
213
AUF
INTAKTE
PFLANZEN
144
5.5.1
AKTIVIERUNG
DER
GENTRANSKRIPTION
144
5.5.2
PANIE
213
-VERMITTELTE
NEKROSENBILDUNG
UND
KALLOSEDEPOSITION
BEI
ARABIDOPSIS
144
5.5.3
OXIDATIVE
BUERST
BEI
ARABIDOPSIS
THALIANA
146
5.5.4
PANIE
213
-VERMITTELTE
INDUKTION
VON
ETHYLEN
148
5.5.5
AKKUMULATION
DES
PHYTOATEXINS
CAMALEXIN
IN
ARABIDOPSISBLAETTERN
149
5.5.6
DIFFERENTIELLE
REAKTIONEN
IN
MONO-UND
DIKOTYLEDONEN
150
5.5.7
PANIE
213
EIN
HITZESTABILER
ELICITOR?
151
6
ZUSAMMENFASSUNG
152
7
LITERATUR
154
NOTIZEN:
_
_
_
_
188 |
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