Mechanismen der zellzyklusabhängigen Transkription:
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| Sprache: | German |
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2006
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| adam_text | Titel: Mechanismen der zellzyklusabhängigen Transkription
Autor: Tschöp, Katrin
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Der Zellzyklus 1
1.2 Regulation des Zellzyklus 2
1.3 Cyclin-abhängige Kinasen und Cycline 4
1.4 Cyclin B und der MPF 5
1.5 Regulation der zellzyklusabhängigen Transkription 7
1.6 DNA-Methylierung als Regulationsmechanismus 10
2 MATERIAL UND METHODEN 14
2.1 Material 14
2.1.1 Bezugsquellen 14
2.1.2 Medien und Puffer 18
2.1.3 Oligonukleotide 24
2.1.4 Vektoren 30
2.1.5 Zelllinien und Bakterienstämme 31
2.2 Methoden 32
2.2.1 Zellkulturbedingungen 32
2.2.2 FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) 32
2.2.3 Präparation von Total-RNA 32
2.2.4 Real-Time RT-PCR 33
2.2.5 Isolierung von genomischer DNA 34
2.2.6 Mutagenese des Wildtyp-mCycB2-Luciferase-Konstruktes 34
2.2.7 Methylierung der Maus-Cyc//n 82-Luciferase-Reporterkonstrukte 35
2.2.8 Transfekü on der methylierten Maus-Cyc//n 82-Luciferase-Reporterkonstrukte 35
2.2.9 Klonierung von AN-UBF 36
2.2.10 Kotransfektion der UBF-, NDH II- und Ezrin-Expressionsplasmide mit dem
Maus-Cyclin 62-Luciferase-Reporterkonstrukt 36
2.2.11 Luciferase-Reporterassay 37
2.2.12 Bisulfit-Sequenzierung 37
Inhaltsverzeichnis
2.2.12.1 Modifikation der genomischen DNA durch Bisulfit 37
2.2.12.2 Methylierungs-spezifische PCR (MS-PCR) und Sequenzierung 38
2.2.13 SNuPE-Reaktion 38
2.2.14 siRNA-Knockdown von UBF 40
2.2.15 Chromatin Immunpräzipitation (ChIP) 40
2.2.16 In w fro-Translation 40
2.2.17 Präparation von Gesamtzell-Proteinlysaten 41
2.2.18 Präparation von Kernproteinextrakten 41
2.2.19 Überexpression von Ezrin und Nterm-Ezrin in NIH-3T3 Zellen 42
2.2.20 Western Blot 42
2.2.21 Klonierung der Wildtyp-BandShift-Sonde des Maus Cyclin 82-Promotors 43
2.2.22 Mutagenese der Wildtyp-EMSA-Sonde des Cyclin 82-Promotors
aus der Maus 43
2.2.23 EMSA (Electrophoretic Mobility-Shift Assay) 44
2.2.24 Herstellung der Konkatamere 44
2.2.25 DNA-Affinitätschromatographie 45
2.2.25.1 Affinitätsreinigung I 45
2.2.25.2 Affinitätsreinigung II 46
2.2.26 BrdU-DNA-Protein-Crosslinking 47
3 ERGEBNISSE 48
3.1 Zellzyklusabhängige Expression von Cyclin B1 und Cyclin B2 48
3.2 DNA-Methylierung und Zellzyklus 52
3.2.1 Der Cyclin 82-Promotor als CpG-lnsel 53
3.2.2 Analyse der Methylierung am murinen Cyclin 82-Promotor 54
3.2.2.1 5-Aza-dC beeinflusst die Expression von Cyclin B2 in der GrPhase
des Zellzyklus 54
3.2.2.2 In vitro-Methylierung verhindert die Aktivierbarkeit des
Cyclin 82-Promotors im Zellzyklus 57
3.2.2.3 In vivo-Methylierungsanalyse des murinen Cyclin 82-Promotors mittels
Bisulfitumwandlung 62
3.2.2.4 Bisulfit-Sequenzierung des murinen Cyclin 82-Promotors 63
3.2.2.5 Quantifizierung des Methylierungsgrades am murinen Cyclin 82-Promotor 69
3.2.3 Bedeutung der DNA-Methyltransferasen Dnmtl und Dnmt3b für den humanen
Cyclin 82-Promotor 75
3.2.3.1 Cyclin B2-Expression in DNA-Methyltransferase negativen HCT116 Zellen 75
Inhaltsverzeichnis
3.2.3.2 In vivo-Methylierungsanalyse des humanen Cyclin ß2-Promotors mittels
Bisulfitumwandlung 77
3.2.3.3 Bisulfit-Sequenzierung des humanen Cyclin S2-Promotors 78
3.2.3.4 SNuPE zur Quantifizierung des Methylierungsgrades am humanen
Cyclin S2-Promotors 80
3.3 Identifikation von CHR-bindenden Proteinen 84
3.3.1 DNA-Affinitätsreinigung am Cyclin B2-Promotor 84
3.3.1.1 Identifikation des Upstream Binding Factors mittels Massenspektroskopie 87
3.3.2 Analyse des Upstream Binding Factors als CHR-bindendes Protein 89
3.3.2.1 Einfluss des Upstream Binding Factors auf die Cyclin ß2-Promotoraktivität 89
3.3.2.2 EMSA-Analysen mit dem Upstream Binding Factor 91
3.3.2.3 In v/Vo-Analysen der UBF-Bindung an dem Cyclin 82-Promotor 95
3.3.2.4 Chromatin-Immunpräzipitation mit UBF 95
3.3.2.5 Funktionsanalyse durch siRNA-Knoc/ccfovw? von UBF 96
3.3.3 Variation der Bedingungen für die DNA-Affinitätsreinigung
am Cyclin 82-Promotor 97
3.3.3.1 Identifikation von NDH II mittels Massenspektroskopie 99
3.3.4 Analyse der Nuclear DNA Helicase II als CHR-bindendes Protein 100
3.3.4.1 Einfluss von NDH II auf die Cyclin ß2-Promotoraktivität 100
3.3.4.2 EMSA-Analysen mit der Nuclear DNA Helicase II (NDH II) 102
3.3.5 Analyse der Ezrin Proteinfamilie als CHR-bindendes Protein 105
3.3.5.1 Einfluss von Ezrin auf die Cyc//n 82-Promotoraktivität 105
3.3.5.2 Bindung von Ezrin in EMSA-Analysen 106
3.3.5.3 Western Blot-Analysen nach DNA-Affinitätsanreicherung 108
3.4 CB-RF als CHR-bindendes Protein 110
4 DISKUSSION 114
5 ZUSAMMENFASSUNG 122
REFERENZEN 123
ABKÜRZUNGEN 130
PUBLIKATIONEN 132
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