Transformation eines embryogenen Zellstammes von Digitalis lanata und Untersuchungen zur Expression der eingeführten Gene während der somatischen Embryogenese:
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1994
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adam_text | TRANSFORMATION EINES EMBRYOGENEN ZELLSTAMMES VON DIGITALIS LANATA UND
UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER EINGEFUEHRTEN GENE WAEHREND DER
SOMATISCHEN EMBRYOGENESE DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN
GRADES DOCTOR RERUM NATURALIUM (DR. RER. NAT.) VORGELEGT DER
MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER
MARTIN-LUTHER-UNIVERSITAET HALLE-WITTENBERG VON HERRN STEFFEN THOMAR
GEBOREN AM: 17. APRIL 1964 IN: MEININGEN GUTACHTER: 1 PROF. M.UCLVCR
(HOAEC) 2. PR*( K.-H (G 3 . F M. M. W HALLE (SAALE), 2 ./}/}.
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 2. TRANSFORMATION DES EMBRYOGENEN
ZELLSTAMMES VM VON DIGITALIS LANATA 8 2.1. TRANSFORMATION DES
EMBRYOGENEN STAMMES VIII VON DIGITALIS LANATA DURCH AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS-VENXAEUEELTEN GENTRANSFER 8 2.1.1. CHARAKTERISIERUNG DES
EMBRYOGENEN ZELLSTAMMES VIII VON DIGITALIS LANATA 8 2.1.2.
CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN BAKTERIENSTAMME UND BINAERVEKTOREN 8
2.1.3. UEBERTRAGUNG DER BINAERVEKTOREN IN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS UND
NACH- WEIS DER UEBERTRAGUNG DURCH KOLONIEHYBRIDISIERUNG 11 2.1.4.
KOKULTIVIERUNG VON AUS PROTOPLASTEN REGENERIERTEN ZELLEN DES DIGITALIS
LANATA-STAMMES VIII MIT ENTSCHAERFTEN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-STAEM- MEN
13 2.1.4.1. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG DER PROTOPLASTEN 13 2.1.4.2.
TOXIZITAET VON KANAMYCIN, GENETICIN UND CEFOTAXIM AUF AUS PROTOPLASTEN
REGENERIERTE ZELLEN VON DIGITALIS LANATA 15 2.1.4.3. KOKULTIVIERUNG DER
AUS PROTOPLASTEN REGENERIERTEN ZELLEN MIT AGROBACTE- RIUM TUMEFACIENS 17
2.1.4.4. VERSUCHE ZUR SELEKTION VON TRANSFORMANDEN 18 2.1.5.
KOKULTIVIERUNG VON PROEMBRYOGENEN SUSPENSIONSZELLEN DES STAMMES VHI VON
DIGITALIS LANATA MIT ENTSCHAERFTEN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-SIZM- MEN 19
2.1.5.1. TOXIZITAET VON KANAMYCIN, GENETICIN UND CEFOTAXIM GEGENUEBER
PROEM- BRYOGENEN SUSPENSIONSZELLEN VON DIGITALIS LANATA 19 2.1.5.2.
EMERSE KOKULTIVIERUNG DER PROEMBRYOGENEN SUSPENSIONSZELLKULTUREN MIT
ENTSCHAERFTEN STAEMMEN VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS UND SELEKTION VON
TRANSFORMANDEN 21 2.1.6. MOLEKULARGENETISCHE NACHWEISE DER INTEGRATION
DER GENE DER T-DNA DES BINAERVEKTORS PBHOL IN DAS GENOM DER
GENETICINRESISTENTEN ZELLEN DES STAMMES VDI VON DIGITALIS LANATA 27
2.1.6.1. NACHWEIS DES GENS NPTU 27 2.1.6.2. NACHWEIS DES GENS GUSA 31
2.2. TRANSFORMATION DES EMBRYOGENEN STAMMES VIII VON DIGITALIS LANATA
DURCH DIREKTEN GENTRANSFER 36 2.2.1. CHARAKTERISIERUNG DER FUER DEN
DIREKTEN GENTRANSFER EINGESETZTEN PLASMID- DNA 36 2.2.2. DIREKTER
GENTRANSFER IN DIGITALIS /ORATFCR-PROTOPLASTEN 37 3. UNTERSUCHUNG DER
EXPRESSION DES GENS GUSA IN SOMATISCHEN EM- BRYONEN DES STAMMES VUEI VON
DIGITALIS LANATA 42 3.1. BILDUNG SOMATISCHER EMBRYONEN AUS
PROEMBRYOGENEN SUSPENSIONSZELLEN 42 3.2. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER
SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAETEN IN SOMATISCHEN EMBRYONEN DER TRANSFORMIERTEN
ZELLINIEN DES STAMMES VHI 45 3.2.1. UNTERSUCHUNG NICHTTRANSFORMIERTER
ZELLEN UND GEWEBE VON DIGITALIS LANATA AUF ENDOGENE GUS-AKTIVITAETEN 45
3.2.2. SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAETEN IM WEISSEN LICHT KULTIVIERTER
TRANSGENER ZELL- KOLONIEN UND SOMATISCHER EMBRYONEN DES STAMMES VIII VON
DIGITALIS LANATA 47 3.2.3. AKTIVITAETEN DER SS-GLUCURONIDASE IN TRANSGENEN
ZEUKOLONIEN UND SOMATI- SCHEN EMBRYONEN DES STAMMES VIII VON DIGITALIS
LANATA INFOLGE DER DURCH LICHT REGULIERTEN GW&4-EXPRESSION 52 3.3.
HISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAET IN SOMATI-
SCHEN EMBRYONEN UND KEIMPFLANZEN DER TRANSGENEN ZELLINIEN DES STAM- MES
VIII VON DIGITALIS LANATA 5 5 4. DISKUSSION 63 5. MATERIALIEN UND
METHODEN 85 5.1. KULTIVIERUNG VON DIGITALIS /AWATO-ZELLKULTUREN 85
5.1.1. NAEHRMEDIEN 85 5.1.2. KULTIVIERUNG VON SUSPENSIONSZELLEN DES
DIGITALIS /AWA/A-STAMMES VHI 86 5.1.3. KULTIVIERUNG SOMATISCHER
EMBRYONEN UND REGENERIERTER KEIMPFLANZEN DES STAMMES VIII VON DIGITALIS
LANATA 87 5.1.4. KULTIVIERUNG TRANSFORMIERTER ZELLEN DES STAMMES VIII
VON DIGITALIS LANATA 87 5.1.5. KULTIVIERUNG TRANSFORMIERTER SOMATISCHER
EMBRYONEN DES STAMMES VIII VON DIGITALIS LANATA 87 5.1.6. ISOLIERUNG VON
PROTOPLASTEN AUS SUSPENSIONSZELLEN DES DIGITALIS LANATA- STAMMES VQI UND
KULTIVIERUNG DER AUS DEN PROTOPLASTEN REGENERIERTEN ZELLEN 88 5.2.
BESTIMMUNG DER TOXIZITAET VON KANAMYCIN, GENETICIN, CEFOTAXIM AUF ZELL-
KULTUREN VON DIGITALIS LANATA 89 5.2.1. TOXIZITAET GEGENUEBER AUS
PROTOPLASTEN REGENERIERTEN ZELLEN 89 5.2.2. TOXIZITAET GEGENUEBER
SUSPENSIONSZELLEN 89 5.3. KULTIVIERUNG DER BAKTERIENKULTUREN 89 5.3.1.
KULTIVIERUNG VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS UND BESTIMMUNG DER ZAHL DER
AGROBAKTERIENZELLEN IM KULTIVIERUNGSMEDIUM 89 5.3.2. KULTIVIERUNG VON
ESCHERICHIA COLI 90 5.4. UEBERTRAGUNG DER BINAERVEKTOREN IN AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS 90 5.5. NACHWEIS DER BINAERVEKTOREN IN AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS 90 5.6. METHODEN DER TRANSFORMATION DES DIGITALIS
LANATA-SIAMMES VIQ 91 5.6.1. KOKULTIVIERUNG VON AUS DIGITALIS
/ANATO-PROTOPLASTEN REGENERIERTEN ZELLEN MIT AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
91 5.6.2. KOKULTIVIERUNG VON PROEMBRYOGENEN SUSPENSIONSZELLEN DES
DIGITALIS /ANA/A-STAMMES VM MIT AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 91 5.6.3.
DIREKTE GENUEBERTRAGUNG IN PROTOPLASTEN DES DIGITALIS LANATA-STAM- MESVM
92 5.7. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 92 5.8. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER
DNA 92 5.9. NACHWEIS DER TRANSFORMATION DER DIGITALIS
/ONATO-ZELLKULTUREN 93 5.9.1. MOLEKULARGENETISCHER NACHWEIS 93 5.9.1.1.
DOT-BLOT-VERFAHREN 93 5.9.1.2. SOUTHERN-VERFAHREN 93 5.9.1.3.
POLYMERASE-KETTENREAKTION 93 5.9.2. BIOCHEMISCH-ENZYMATISCHER NACHWEIS
94 5.9.2.1. FLUORIMETRISCHER GUS-ASSAY 94 5.9.2.2. HISTOCHEMISCHER
GUS-ASSAY 94 5.10. DNA-RESTRIKTIONSANALYSE 94 5.11. RADIOAKTIVE
MARKIERUNG VON DNA 95 5.12. HYBRIDISIERUNG MEMBRANGEBUNDENER DNA MIT
RADIOAKTIV MARKIERTEN SON- DEN 95 5.13. AUTORADIOGRAPHIE 95 5.14.
LICHTBEDINGUNGEN BEI DER KULTIVIERUNG DER DIGITALIS FANATA-ZELLKULTUREN
95 5.15. CHLOROPHYLLBESTIMMUNG 95 5.16. BESTIMMUNG DER VITALITAET VON
PROTOPLASTEN 95 6. ZUSAMMENFASSUNG 96 7. LITERATUR 98
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