Charakterisierung des membranassoziierten Transkriptionskomplexes von Plastiden der Gerste (Hordeum vulgare L.):
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| adam_text | CHARAKTERISIERUNG DES MEMBRANASSOZIIERTEN TRANSKRIPTIONSKOMPLEXES VON
PLASTIDEN DER GERSTE (HORDEUM VULGAERE L.) DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES DES FACHBEREICHS BIOLOGIE DER UNIVERSITAET HAMBURG VORGELEGT
VON ROLAND SUCK AUS BREMEN HAMBURG 1996 INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG 1 1.
DIFFERENZIERUNG VON PLASTIDEN 1 2. GENETISCHE ORGANISATION VON PLASTIDEN
3 2.1 DAS PIASTOM 3 2.2 INTERAKTION ZWISCHEN ZELLKERN UND PLASTIDE 5 3.
REGULATION DER GENEXPRESSION IN PLASTIDEN 6 4. PLASTIDAERE
RNA-POLYMERASEN 10 4.1 DIE LOESLICHE DNA-ABHAENGIGE RNA-POLYMERASE (SRNAP)
10 4.2 DER TRANSKRIPTIONSAKTIVE KOMPLEX (TAC) 12 4.3 MOEGLICHE
KODIERUNGSORTE DER PLASTIDAEREN RNA-POLYMERASEN 14 4.4 BISHERIGE
ERGEBNISSE VON UNTERSUCHUNGEN DES TRANSKRIPTIONSAPPARA- 15 TES IN
GERSTENPIASTIDEN 5. ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 16 II. MATERIAL UND
METHODEN 18 1. MATERIAL 18 1.1 PFLANZENMATERIAL 18 1.2 VEKTOREN UND
BAKTERIENSTAEMME 18 1.3 CHEMIKALIEN UND ENZYME 18 1.4
NUKLEINSAEURE-LAENGENSTANDARDS UND MOLEKULARGEWICHTSMARKER 19 1.5
ANTISEREN 19 1.6 PLASTIDEN-DNA-KLONE UND DNA-OLIGONUKLEOTIDE 20 2.
METHODEN 20 2.1 ANZUCHT DER PFLANZEN , 20 2.2 ISOLIERUNG VON PROTEINEN
AUS GERSTENKEIMLINGEN 21 2.3 ISOLIERUNG VON PLASTIDEN AUS GERSTE 21 2.4
ISOLIERUNG VON TRANSKRIPTIONSAKTIVEN FRAKTIONEN AUS PLASTIDEN 22 2.4.1
ISOLIERUNG DER LOESLICHEN RNA-POLYMERASE (SRNAP) 22 2.4.2 ISOLIERUNG VON
TRANSKRIPTIONSAKTIVEN KOMPLEXEN (TAC) 23 2.4.3 MODIFIKATIONEN BEI DER
ISOLIERUNG VON TRANSKRIPTIONSAKTIVEN KOMPLEXEN 23 2.4.4 BESTIMMUNG DER
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON TAC-EXTRAKTEN 24 2.4.5 BESTIMMUNG DER
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON TAC-EXTRAKTEN IN ANWE- 24 SENHEIT VON
TRANSKRIPTIONSHEMMSTOFFEN 2.5 ANALYSE VON PROTEINEN 25 2.5.1 FAELLUNG VON
PROTEINEN UND QUANTIFIZIERUNG RESUSPENDIERTER PROTEINE 25
INHALTSVERZEICHNIS 2.5.2 EINDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
(SDS-PAGE) 25 2.5.3 ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
(2-D) 25 2.5.4 FAERBUNG VON GELELEKTROPHORETISCH AUFGETRENNTEN PROTEINEN
26 2.5.5 SPEZIFISCHE PROTEOLYSE VON AUFGETRENNTEN PROTEINEN 26 2.5.6
SEQUENZIERUNG VON PROTEINFRAGMENTEN 27 2.5.7 TRANSFER VON PROTEINEN AUF
MEMBRANEN ( WESTERN BLOF) 28 2.5.8 IMMUNDEKORATION IMMOBILISIERTER
PROTEINE UND MEHRFACHVERWENDUNG 29 VON WESTERN BLOTS 2.6
IDENTIFIZIERUNG FUNKTIONELLER PROTEINE AUS TAC-EXTRAKTEN 29 2.6.1
PHOSPHORYLIERUNGSANALYSEN 29 2.6.2 PHOTOMARKIERUNG VON PROTEINEN DES
TRANSKRIPTIONSKOMPLEXES 29 2.6.3 IDENTIFIZIERUNG VON DNA-BINDENDEN
PROTEINEN 31 2.7 HYBRIDISIERUNGEN MIT TAC-TRANSKRIPTEN 31 2.7.1
ISOLIERUNG VON KLONIERTER DNA 31 2.7.2 REINIGUNG VON EINZELSTRAENGIGER
DNA UND OLIGONUKLEOTIDEN 32 2.7.3 QUANTIFIZIERUNG VON DNA 32 2.7.4
RESTRIKTION VON DNA 32 2.7.5 DNA-SEQUENZIERUNG 33 2.7.6
GELELEKTROPHORESE UND TRANSFER VON EINZELSTRAENGIGER DNA 33 2.7.7
HERSTELLUNG VON DOT BLOT -MEMBRANEN 33 2.7.8 IN WFRO-TRANSKRIPTION VON
KLONIERTER DNA 34 2.7.9 RADIOAKTIVE IN VRFRO-TRANSKRIPTION MIT
TAC-EXTRAKTEN 34 2.7.10 DNA/RNA- UND RNA/RNA-HYBRIDISIERUNG MIT
TAC-TRANSKRIPTEN 35 2.8 HYBRIDISIERUNGEN MIT DNA-SONDEN 35 2.8.1
ISOLIERUNG VON DNA AUS PFLANZENMATERIAL 35 2.8.2 GELELEKTROPHORESE UND
TRANSFER VON DOPPELSTRAENGIGER DNA 36 2.8.3 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN
AUS AGAROSEGELEN 36 2.8.4 MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 36 2.8.5 ISOLIERUNG
UND QUANTIFIZIERUNG VON RNA AUS GERSTENKEIMLINGEN 37 2.8.6 ISOLIERUNG
VON POLY(A)+-RNA 37 2.8.7 GELELEKTROPHORESE UND TRANSFER VON RNA 38
2.8.8 RNA/DNA- UND DNA/DNA-HYBRIDISIERUNGEN 38 2.9 IMMUNPRAEZIPITATION
VON IN V/FRO-TRANSLATIONSPRODUKTEN 38 III. ERGEBNISSE 40 1.
CHARAKTERISIERUNG VON TRANSKRIPTIONSAKTIVEN KOMPLEXEN (TAC) 40 1.1
FUNKTIONELLE ANALYSE VON TAC-EXTRAKTEN AUS PLASTIDEN VERSCHIEDENER 41
ENTWICKLUNGSSTADIEN 1.1.1 SUBKLONIERUNG DES FRNE-GENS AUS DEM PLASMID
PHVC 208-1.6 42 1.1.2 ANALYSE DES REINHEITSGRADES VON PRAEPARATIONEN
EINZELSTRAENGIGER DNA 43 INHALTSVERZEICHNIS 1.1.3 VERGLEICHENDE ANALYSE
DER IN VITRO VERLAENGERTEN TRANSKRIPTE VON TAC- 45 EXTRAKTEN 1.2
UNTERSUCHUNGEN ZUR PROTEINZUSAMMENSETZUNG VON TAC-EXTRAKTEN 49 1.3
SEQUENZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TAC-PROTEINEN 54 1.3.1
PROTEOLYSE UND SEQUENZIERUNG DES 154 KDA UND 158 KDA PROTEINS 54 1.3.2
PROTEOLYSE UND SEQUENZIERUNG VON TAC-PROTEINEN IM MITTLEREN MOLE- 59
KULARGEWICHTSBEREICH (17 BIS 69 KDA) 1.4 IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
VON PROTEINEN IN TAC-EXTRAKTEN UND 62 SRNAP-PRAEPARATIONEN 1.4.1
IMMUNOLOGISCHE ANALYSE ZWEIDIMENSIONAL AUFGETRENNTER TAC-EXTRAKTE 71 1.5
PHOSPHORYLIERUNG UND PHOTOMARKIERUNG VON UNTEREINHEITEN DES 73
TRANSKRIPTIONSKOMPLEXES 1.6 UNTERSUCHUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON FUER DIE
RNA-POLYMERASEAKTIVITAET 80 RELEVANTEN PROTEINEN IN TAC-EXTRAKTEN 1.6.1
ANALYSE DES ELUTIONSPROFILS VON TAC-EXTRAKTEN BEI DER GELFILTRATION 80
1.6.2 VERSUCHE ZUR REINIGUNG DES TRANSKRIPTIONSAPPARATES VON TAC- 83
EXTRAKTEN 2. UNTERSUCHUNGEN ZUM KODIERUNGSORT DES 154/158 KDA
TAC-PROTEINS 92 2.1 HYBRIDISIERUNGEN MIT VON DEN AMINOSAEURESEQUENZEN DES
154/158 KDA 92 TAC-PROTEINS ABGELEITETEN OLIGONUKLEOTIDEN 2.2
CHARAKTERISIERUNG DES GEGEN DAS 154/158 KDA PROTEIN GERICHTETEN 96
154/8-TAC ANTIKOERPERS 2.3 IMMUNPRAEZIPITATION VON IN V/FRO-TRANSLATIERTEN
PROTEINEN MIT DEM 154/8- 98 TAC ANTIKOERPER IV. DISKUSSION 102 1.
MOLEKULARE ZUSAMMENSETZUNG VON TRANSKRIPTIONSKOMPLEXEN 102 1.1
POTENTIELLE GRUNDKOMPONENTEN DER RNA-POLYMERASE IN TAC-EXTRAKTEN 103 1.2
ENTWICKLUNGSABHAENGIG IN TAC-EXTRAKTEN AUS CHLOROPLASTEN VORHAN- 110 DENE
KOMPONENTEN 2. DER PLASTIDAERE TRANSKRIPTIONSAPPARAT 116 2.1 MODELL DER
RNA-POLYMERASE IN TAC-EXTRAKTEN UND IHR KODIERUNGSORT 116 2.2 MOEGLICHE
BEDEUTUNG DER BETEILIGUNG MEHRERER RNA-POLYMERASEN AM 120 PLASTIDAEREN
TRANSKRIPTIONSAPPARAT 3. AUSBLICK 123 V. ZUSAMMENFASSUNG 125 VI.
LITERATURVERZEICHNIS 128
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