Polyadenylierung von prä-mRNA in Saccharomyces cerevisiae: strukturelle Voraussetzungen der Vorläufer-mRNA und Identifizierung von Proteinfaktoren
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Utz, Wiss.
1997
|
| Schriftenreihe: | Biochemie
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
| Beschreibung: | III, 169 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3896751719 |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
14
2.1
MATERIAL
_
.14
2.1.1
GERAETE
.
14
2.1.2
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
.
15
2.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
.
18
2.1.4
ENZYME
.
18
2.1.5
ANTIKOERPER
.
19
2.1.6
LOESUNGEN,
PUFFER
UND
KULTURMEDIEN
.
19
2.1.6.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
19
2.1.6.2
KULTURMEDIEN
.
20
2.1.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
HILFSMITTEL
.
21
2.1.8
HEFE
UND
BAKTERIENSTAEMME
.
22
2.1.8.1
HEFESTAEMME
.
22
2.1.8.2
BAKTERIENSTAEMME
.
22
2.1.9
DNA
UND
PROTEIN-LAENGENSTANDARDS
.
22
2.1.9.1
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
22
2.1.9.2
PROTEIN-LAENGENSTANDARDS
.
23
2.1.10
PLASMIDE
.
24
2.1.11
OLIGONUKLEOTIDE
.
24
2.2
METHODEN
.
27
2.2.1
KULTURTECHNIKEN
.
27
2.2.1.1
STERILES
ARBEITEN
MIT
BAKTERIENKULTUREN
UND
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
27
2.2.1.2
ANZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
.
28
2.2.1.3
ANZUCHT
VON
HEFEKULTUREN
.
28
2.2.1.4
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
.
28
2.2.1.5
SPORULATION
VON
DIPLOIDEN
HEFEZELLEN
.
29
2.2.1.6
TETRADENANALYSE
.
29
2.2.2
DNA-ARBEITSTECHNIKEN
.
30
2.2.2.1
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
COLI
.
30
2.2.2.2
BESTIMMUNG
VON
DNA-KONZENTRATIONEN
.
31
2.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
HEFE-DNA
.
32
2.2.2.4
TRANSFORMATION
VON
.
COLI
.
33
2.2.2.5
TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
.
34
2.2.2.6
CHLOROPANE-EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
35
2.2.2.7
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
AUS
KAELBERDARM
.
36
2.2.2.8
LIGATION
VON
DNA
.
36
2.2.2.9
DNA-SEQUENZIERUNG
.
37
2.2.2.10
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
39
2.2.2.11
REINIGUNG
VON
SYNTHETISCHEN
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDEN.
40
2.2.2.12
AUFFIULEN
VON
5
'
-UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
.
41
2.2.2.13
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
42
2.2.2.14
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
42
2.2.2.15
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
.
43
2.2.2.16
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDEN
AM
5
'
-ENDE
.
44
2.2.3
RNA-ARBEITSTECHNIKEN
.
44
2.2.3.1
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
44
2.2.3
2
NATIVE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
45
2.2.3.3
NORTHERN
BLOT
VON
RNA
AUF
NYLONMEMBRAN
.
46
2.2.3.4
HERSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
RNA-MOLEKUELEN
DURCH
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
46
2.2.3.5
QUANTIFIZIERUNG
DER
STOFFMENGE
AN
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
RNA-TRANSKRIPTEN
.
47
2.23.6
ZIRKULARISIERUNG
VON
RNA
MIT
T4-RNA-LIGASE
.
48
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.23.7
ZIRKULARISIERUNG
VON
RNA
MIT
T4-DNA-LIGASE
UND
EINEM
SYNTHETISCHEN
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTID
.
49
2.2.3.8
IN
VITRO
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
VON
MRNA-VORLAEUFEM
IN
S.
CEREVIRIAE-GANZZELLEXTRAKT
.
49
2.2.3.9
HERSTELLUNG
VON
VORGESCHNITTENER
PRAE-MRNA
.
51
2.2.3.10
IN
VITRO
POLYADENYLIERUNGSREAKTION
VON
VORGESCHNITTENEN
MRNA-VORLAEUFEM
IN
5.
CEREVISIAE-
GANZZELLEXTRAKT
.
51
2.2.3.11
TEST
AUF
UNSPEZIFISCHE
POLY(A)-POLYMERASE
AKTIVITAET
.
52
2.2.3.12
IN
VITRO
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
VON
MRNA-VORLAEUFEM
IN
HELA-ZELLKEMEXTRAKT
.
52
2.2.3.13
HYBRIDISIERUNG
VON
2
'
-O-METHYL
RNA-OLIGORIBONUKLEOTIDEN
AN
MRNA-VORLAEUFER
.
53
2.2.3.14
RNASE
A/T
R
ABBAU
VON
RNA
.
54
2.2.3.15
PARTIELLE
RNASE
T
R
HYDROLYSE
VON
RNA
.
54
2.2.3.16
RNASE
H-HYDROLYSE
VON
RNA/DNA
HYBRIDEN
.
55
2.2.3.17
YYPRIMER
EXTENSION
"
-ANALYSE
.
55
2.2.4
PROTEIN-ARBEITSTECHNIKEN
.
56
2.2.4.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
56
2.2.4.2
COOTNASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
57
2.2.4.3
SILBER-FAERBUNG VON
PROTEINGELEN
.
57
2.2.4.4
BESTIMMUNG
DER
PROTEIN-KONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
58
2.2.4.5
WESTEM-BLOT-ANALYSE
.
58
2.2.4.6
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
IN
E.
COLI
.
60
2.2.4.7
AUFSCHLUSS
VON
E.
COLI
BAKTERIENZELLEN
MIT
ULTRASCHALL
.
60
2.2.4.8
AUFREINIGUNG
VON
PROTEINEN
UEBER
NI
2+
-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
61
2.2.4.9
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
IN
KANINCHEN
.
62
2.2.4.10
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
UEBER
PROTEIN
A-SEPHAROSE
.
63
2.2.4.11
IMMUNDEPLETION
EINES
HEFE-GANZZELLEXTRAKTES
.
63
2.2.4.12
PRAEPARATION
VON
HEFE-GESAMTPROTEINEN
.
63
2.2.4.13
PRAEPARATION
EINES
HEFE-GANZZELLEXTRAKTES
FUER
DIE
IN
VITRO
3
'
-PROZESSIERUNG
VON
MRNA-VORLAEUFEM
.64
2.2.4.14
PARTIELLE
FRAKTIONIERUNG
EINES
HEFE-GANZZELLEXTRAKTES
UEBER
ANUNONIUMSULFATFAELLUNG
.
66
2.2.4.15
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
EINES
HEFE-GANZZELLEXTRAKTES
UEBER
EINE
MONO
Q-SAEULE
.67
2.2.4.16
IN
VITRO
TRANSLATION
REKOMBINANTER
PROTEINE
IN
EINEM
RETIKULOZYTEN-LYSAT
.68
2.2.4.17
UNTERSUCHUNG
VON
INTERAKTIONEN
IN
VITRO
TRANSFERIERTER
PROTEINE
DURCH
COIMMUNOPRAEZIPITATION
.68
2.2.5
COMPUTERANALYSEN
.
69
3
ERGEBNISSE
-----------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
70
3.1
STRUKTURELLE
VORAUSSETZUNGEN
EINER
PRAE-MRNA
FUER
DIE
3
'
-PROZESSIERUNG
BI
VITRO
.
70
3.1.1
UNTERSUCHUNGEN
IM
S.
CEREVISIAE
IN
VITRO
SYSTEM
.
70
3.1.1.1
KONSTRUKTION
VON
ZIRKULAERER
PRAE-MRNA
AUS
DEN
3
'
-TERMINALEN
REGIONEN
DES
CYC1
UND
DES
ADHL-GENS
.
70
3.1.1.2
ZIRKULAERE
VORLAEUFER-RNAS
WERDEN
NICHT
AN
DER
POLYADENYLIERUNGSSTELLE
GESCHNITTEN
UND
POLYADENYLIERT
.
74
3.1.1.3
EINFUEGEN
VON
HAAMADELSTRUKTUREN
AN
DIE
ENDEN
EINER
SYNTHETISCHEN
CFCF-PRAE-RNRNA
.
80
3.1.1.4
NACHWEIS
DER
SEKUNDAERSTRUKTURAUSBILDUNG
VERSCHIEDENER
VORLAEUFER-RNAS
.
81
3.1.1.5
TERMINALE
HAAMADELSTRUKTUREN
IN
DER
PRAE-MRNA
HABEN
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
EFFIZIENZ
DER
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
.
83
3.
1
.1.6
2
'
-O-METHYL-OLIGORIBONUKLEOTIDE,
DIE
KOMPLEMENTAER
ZU
DEN
ENDEN
EINER
PRAE-MRNA
SIND,
HABEN
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
.
84
3.1.1.7
KONSTRUKTION
PSEUDOZIRKULAERER
CFCI-PRAE-MRNAS
.
86
3.1.1.8
EINE
PSEUDOZIRKULAERE
STRUKTUR
DER
PRAE-MRNA
VERHINDERT
DIE
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
.
88
3.1.1.9
SENSITIVITAET
EINER
ZIRKULAEREN
UND
EINER
LINEAREN
RNA
GEGENUEBER
EINER
ENDORIBONUKLEASE
.
93
3.1.1.10
ZIRKULAERE
UND LINEARE
RNA
ZEIGEN
GLEICHES
LAUFVERHALTEN
BEI
EINER
NATIVEN
GELELEKTROPHORESE.
95
3.1.1.11
EINFLUSS
VON
ANTISENSE
2
'
-O-METHYL-OIIGORIBONUKLEOTIDEN
AUF
DIE
SELEKTION
VON
POLYADENYLIERUNGSSTELLEN
DES
ADHL-GCM
.
96
3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
IM
SAEUGER
IN
VITRO
SYSTEM
.
99
3.1.2.1
ETABLIERUNG
EINES
IN
VITRO
SYSTEMS
FUER
DIE
3
'
-PROZESSIERUNG
VON
PRAE-MRNA
IN
EINEM
HELA
ZELLKEMEXTRAKT
.
99
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.1.2.2
EINE
PSEUDOZIRKULAERE
STRUKTUR
DER
PRAE-MRNA
VERHINDERT
DIE
3
'
-PROZESSIERUNGSREAKTION
IM
HELA-ZELLKEMEXTRAKT
.
100
3.2
PARTIELLE
AUFREINIGUNG
EINES
HEFE-GESAMTZELLEXTRAKTES
UND
KLONIERUNG
ALLER
IN
S.
CEREVISIAE
BISHER
BEKANNTEN
3
'
-PROZESSIERUNGSFAKTOREN
.
104
3.2.1
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
DER
POTY(A)-POLYMERASE
UND
DER
SCHNEIDEFAKTOREN
CF
I
UND
CF
II
UEBER
EINE
MONO
Q-SAEULE
.
104
3.2.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
POLY(A)-POLYMERASE
UEBER
EINE
UNSPEZIFISCHE
POLYADENYLIERUNGSREAKTION
.
105
3.2.3
IDENTIFIZIERUNG
VON
CF
I
UND
CF
II
DURCH
REKONSTITUTION
DES
ENDONUKLEOLYTISCHEN
SCHNITTES
.
106
3.2.4
KLONIERUNG
DER
PAPI-,
RNA14-,
RNA15
UND
FIPL-GEM
AUS
GENOMISCHER
HEFE-DNA
UEBER
PCR
.
107
3.2.5
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
RNA14
UND
RNA15-PROTEINE.
108
3.3
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
CFT1
ALS
ESSENTIELLER
3
'
-PROZESSIERNNGSFAKTOR
------------
110
3.3.1
HOMOLOGIE
VON
CFT1
ZUM
HUMANEN
AAUAAA-BINDENDEN
FAKTOR
.
110
3.3.2
DAS
CF77-GEN
IST
ESSENTIELL
FUER
DAS
HEFEWACHSTUM
.
110
3.3.3
KLONIERUNG
DES
CFTL-GENS
AUS
GENOMISCHER
HEFE-DNA
DURCH
PCR
.
113
3.3.4
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
CFT1-PROTEIN
IN
E
COLI
.
115
3.3.5
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
IN
E.
COLI
EXPRIMIERTES
CFTL-PROTEIN
.
116
3.3.6
INAKTIVIERUNG
DER
3
'
-PROZESSIERUNGSAKTIVITAET
EINES
HEFEEXTRAKTES
DURCH
IMMUNDEPLETION
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
CFTL-PROTEIN
.
117
3.3.7
DAS
CHROMATOGRAPHISCHE
VERHALTEN
DES
CFTL-PROTEINS
KORRELIERT
MIT
DER
CF
II-AKTIVITAET
.
119
3.3.8
REKONSTITUTION
DER
SCHNEIDEAKTIVITAET
EINES
MIT
CFTLP-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
DEPUTIERTEN
HEFEEXTRAKTES
DURCH
KOMPLEMENTATION
MIT
CF
II-FRAKTIONEN
.
121
3.3.9
INHIBIERUNG
DER
SPEZIFISCHEN
POLYADENYLIERUNG
VON
VORGESCHNITTENER
PRAE-MRNA
IN
EINEM
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
CFTL-PROTEIN
DEPUTIERTEN
HEFEEXTRAKT
.
121
3.3.10
REKONSTITUTION
DER
POLYADENYLIERUNG
IN
EINEM
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
CFTL-PROTEIN
DEPUTIERTEN
HEFEEXTRAKT
DURCH
KOMPLEMENTATION
MIT
PAP
UND
PF
I-FRAKTIONEN
.
124
3.4
IDENTIFIZIERUNG
EINES
WEITEREN
3
'
-PROZESSIERUNGSFAKTORS,
DER
MIT
DEM
CFTL-PROTEIN
INTERAGIERT
_
126
3.4.1
HOMOLOGIE
DES
CFT2-PROTEINS
MIT
DER
100
KD-UNTEREINHEIT
VON
CPSF
AUS
RIND
.
126
3.4.2
KLONIERUNG
DES
CFT2-GMS
UND
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
REKOMBINANT
EXPRIMIERTES
CFT2-PROTEIN
.
126
3.4.3
DIE
ELUTION
DES
CFT2-PROTEINS
KORRELIERT
MIT
DER
CF
II-AKTIVITAET
.
128
3.4.4
INAKTIVIERUNG
DER
3
'
-PROZESSIERUNGSAKTIVITAET
EINES
HEFEEXTRAKTES
DURCH
IMMUNDEPLETION
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
CFT2-PROTEIN
.
129
3.4.5
DAS
CFT2-PROTEIN
COINUNUNOPRAEZIPITIERT
IN
EINEM
KOMPLEX
MIT
DEM
CFTL-PROTEIN
UND
WEITEREN
3
'
-
PROZESSIERUNGSFAKTOREN
.
130
4
DISKUSSION
135
4.1
STRUKTURELLE
VORAUSSETZUNGEN
EINER
PRAE-MRNA
BEI
DER
3
'
-PROZESSIERUNG.
_
.135
4.2
EIN
MODELL
ZUR
BEDEUTUNG
DER
RNA-STRUKTUR
BEI
DER
3
'
-PROZESSIERUNG
.
137
43
HOMOLOGIEN
VON
3
'
-PROZESSIERUNGSFAKTOREN
IN
S.
CEREVISIAE
UND
HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
140
4.4
3
'
-PROZESSIERUNG
UND
SPLEISSEN
.
-
.
143
4.5
BILDEN
DIE
AN
DER
3
'
-PROZESSIERUNG
BETEILIGTEN
FAKTOREN
EINEN
KOMPLEX
-
DAS
POLY(A)SOM?
.
145
4.6
AUSBLICK
.
.149
5
ZUSAMMENFASSUNG
151
6
LITERATURVERZEICHNIS
_
153 |
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