Isolierung und Charakterisierung einer neuartigen Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase aus Neurospora crassa:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
IMMUNSUPPRESSIVEN
AGENTIEN
1
1.1.1
MAKROCYCLISCHE
LAKTONE:
FK506
UND
RAPAMYCIN
1
1.1.2
CYCLOSPORIN
A
2
1.2
DIE
BINDEPROTEINE
DER
IMMUNSUPPRESSIVA:
IMMUNOPHILINE
3
1.2.1
DIE
CYCLOPHILIN-PROTEINFAMILIE
3
1.2.2
DIE
FK506-BINDEPROTEIN-FAMILIE
6
1.3
DIE
PEPTIDYL-PROLYL
CIS/TRANS
ISOMERASEAKTIVITAET
8
1.4
IMMUNOPHILINE
UND
IMMUNSUPPRESSION
10
1.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
12
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
13
2.1
MATERIAL
13
2.1.1
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
13
2.1.2
SUBSTRATE
FUER
DEN
ISOMERASE-AKITVITAETSTEST
14
2.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
15
2.1.4
ENZYME
UND
ANTIKOERPER
15
2.1.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDS
UND
KITS
15
2.1.6
GERAETE
15
2.2
METHODEN
16
2.2.1
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
16
2.2.1.1
ANZUCHT
UND
KULTIVIERUNG
VON
N.
CRASSA
16
2.2.1.2
PRAEPARATION
VON
GESAMTEXTRAKT
18
2.2.1.3
ISOLATION
VON
VERSCHIEDENEN
KOMPARTIMENTEN
AUS
N.
CRASSA
18
2.2.1.3.1
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
18
2.2.1.3.2
ISOLIERUNG
VON
CYTOSOL
19
2.2.1.3.3
ISOLIERUNG
VON
MIKROSOMEN
19
2.2.1.3.4
ISOLIERUNG
VON
KERNEN
19
2.2.1.4
QUANTITATIVE
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
20
2.2.1.5
GELELEKTROPHORESE
20
2.2.1.5.1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
20
2.2.1.5.2
HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
21
2.2.1.6
COOMASSIE
BLAU
FAERBUNG
22
2.2.1.7
WESTERN-BLOT
23
2.2.1.8
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
23
2.2.1.9
ANTIKOERPERBINDUNG
(IMMUNOBLOT)
24
2.2.1.10
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
24
2.2.1.11
TCA-FAELLUNG
25
2.2.1.12
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
25
INHALTSVERZEICNNIS
2.2.1.13
REINIGUNG
VON
FKBP29
26
2.2.1.13.1
AMMONIUMSULFATPRAEZIPITATION
26
2.2.1.13.2
DE52-ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
27
2.2.1.13.3
MONO
Q-ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
27
2.2.1.13.4
GEL
PERMEATIONS-CHROMATOGRAPHIE
28
2.2.1.13.5
ISOELEKTRISCHE
CHROMATOFOKUSSIERUNG
28
2.2.1.14
NACHWEIS
DER
GLYKOSYLIERUNG
29
2.2.1.14.1
PAS-FAERBUNG
29
2.2.1.14.2
LEKTIN-NACHWEIS
29
2.2.1.15
ELEKTROSPRAY-MASSENSPEKTROSKOPIE
30
2.2.1.16
BESTIMMUNG
DER
PEPTIDYL-PROLYL
CISARANS
ISOMERASEAKTIVITAET
30
2.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
31
2.2.2.1
MEDIEN
UND
PUFFER
31
2.2.22
CDNA-GENBIBLIOTHEK
VON
N.
CRASSA
32
2.22.3
VEKTOR
33
2.22.4
BAKTERIENSTAEMME
(ESCHERICHIA
COLI)
33
2.2.2.5
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
33
2.2.2.6
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
34
2.22.7
PRAEPARATION
VON
DNA
34
2.2.2.7.1
MINIPRAEPERATION
VON
PLASMID-DNA
34
2.2.27.2
MAXIPRAEPERATION
VON
PLASMID-DNA
35
2.2.28
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DER
PCR
35
2.2.29
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
36
2.2.2.10
EXTRAKTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
36
2.2.2.10.1
QIAEX
AGAROSEGEL-EXTRAKTION
36
2.2.2.10.2
EXTRAKTION
DURCH
AUSFRIEREN
DER
DNA
36
2.2.2.11
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
VON
DNA
37
2.2.2.11.1
RESTRI
KTIONSENDONUKLEASEN
37
2.2.2.11.2
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
37
2.2.2.11.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
38
2.2.2.11.4
UEBERFUEHRUNG
UEBERHAENGENDER
IN
GLATTE
ENDEN
38
2.2.2.11.5
PHOSPHORYLIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
38
2.2.2.11.6
LIGATION
39
2.2.2.12
TRANSFER
UND
NACHWEIS
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
39
2.2.2.13
TRANSFORMATION
VON
E
COLI
MIT
PLASMIDEN
40
2.2.2.13.1
TRANSFORMATION
MIT
CACI
2
40
2.2.2.13.2
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
40
2.2.2.14
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
41
2.2.2.14.1
DENATURIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
41
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2.14.2
SEQUENZIERUNG
MIT
T7-DNA-POLYMERASE
41
2.2.2.14.3
DENATURIERENDE
SEQUENZGELE
41
2.2.2.15
DURCHMUSTERN
VON
GENBIBLIOTHEKEN
42
2.2.2.15.1
INFEKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
K-PHAGEN
42
2.2.2.15.2
DURCHMUSTERUNG
VON
GENBIBLIOTHEKEN
IN
ZGT1
1
MIT
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
42
2.2.2.15.3
DURCHMUSTERN
VON
GENBIBLIOTHEKEN
IN
KGT1
1
MIT
EINER
RADIOAKTIV-MARKIERTEN
DNA-SONDE
43
2.2.2.16
RETROBLOT-ANALYSEN
43
3.
ERGEBNISSE
44
3.1
NACHWEIS
VON
IMMUNOPHILINEN
IN
N.
CRASSA
44
3.1.1
NACHWEIS
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
CYCLOPHILINE
44
3.1.2
NACHWEIS
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
FKBPS
46
3.2
REINIGUNG
VON
FKBP29
48
3.2.1
HERSTELLUNG
VON
GESAMTEXTRAKT
48
3.2.2
AMMONIUMSULFAT-PRAEZIPITATION
50
3.2.3
ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
51
3.2.3.1
DE52-ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE,
PH
6,0
52
3.2.32
MONO
Q-ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE,
PH
7,4
53
3.2.4
GEL
PERMEATIONS
CHROMATOGRAPHIE
54
3.2.5
ISOELEKTRISCHE
CHROMATOFOKUSSIERUNG
55
3.2.6
ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG
DER
REINIGUNG
VON
FKBP29
57
3.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
FKBP29
58
3.3.1
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
58
3.3.1.1
SUBSTRATSPEZIFITAET
59
3.3.1.2
EINFLUSS
VON
INHIBITOREN
AUF
DIE
ENZYMAKTIVITAET
VON
FKBP29
61
3.3.1.2.1
EINFLUSS
VON
FK506
61
3.3.1.2.2
EINFLUSS
VON
RAPAMYCIN
62
3.3.2
SUBZELLULAERE
LOKALISIERUNG
VON
FKBP29
UND
CYP45
63
3.3.2.1
LOKALISIERUNG
VON
CYP45
63
3.3.2.2
LOKALISIERUNG
VON
FKBP29
64
3.3.3
NACHWEIS
DER
GLYKOSILIERUNG
VON
FKBP29
65
3.3.3.1
PAS-FAERBUNG
65
33.3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GLUKANSTRUKTUR
VON
FKBP29
66
3.3.4
BESTIMMUNG
DER
MOLEKULARMASSE
VON
FKBP29
69
INHALTSVERZEICHNIS
3.4
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA
VON
FKBP29
70
3.4.1
SCREENING
DER
GENBIBLIOTEK
MIT
EINEM
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER
70
3.4.2
GEWINNUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
71
3.4.3
DURCHMUSTERUNG
EINER
AEGT11
-GENBIBLIOTEK
MIT
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
74
4.
DISKUSSION
77
4.1
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
IMMUNOPHILINE
77
4.1.1
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
CYCLOPHILINE
77
4.1.2
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
FK506-BINDEPROTEINE
79
4.2
REINIGUNG
VON
FKBP29
79
4.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
FKBP29
81
4.3.1
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
81
4.3.2
SUBZELLULAERE
LOKALISIERUNG
VON
NEUARTIGEN
ISOMERASEN
82
4.3.2.1
LOKALISIERUNG
VON
CYP45
82
4.S.2.2
LOKALISIERUNG
VON
FKBP29
83
4.3.2.3
GLYKOSILIERUNG
VON
FKBP29
83
4.3.2.4
ELEKTROSPRAY-MASSENSPEKTROSKOPIE
VON
FKBP29
85
4.4
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA
VON
FKBP29
85
4.4.1
DURCHMUSTERUNG
DER
GENBIBLIOTHEKEN
MIT
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
86
4.4.2
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
86
4.4.3
DURCHMUSTERUNG
DER
GENBIBLIOTHEKEN
MIT
DER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
87
5.
ZUSAMMENFASSUNG
89
6.
LITERATURVERZEICHNIS
90 |
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| spelling | Solscheid, Bernd Verfasser aut Isolierung und Charakterisierung einer neuartigen Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase aus Neurospora crassa vorgelegt von Bernd Solscheid 1994 101 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Freiburg (Breisgau), Univ., Diss. Neurospora crassa (DE-588)4171597-4 gnd rswk-swf Cyclophilin (DE-588)4332417-4 gnd rswk-swf Isolierung Chemie (DE-588)4122223-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Neurospora crassa (DE-588)4171597-4 s Cyclophilin (DE-588)4332417-4 s Isolierung Chemie (DE-588)4122223-4 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006724843&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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