Darstellung von Mutationen im Malignen Melanom mittels Competitive-multiplex-PCR und Arbitrarily-primed-PCR:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das maligne Melanom 1
1.2 Molekulare Onkogenese des malignen Melanoms 6
1.2.1 Mechanismen der molekularen Onkogenese 6
1.2.2 CDKN2A/pl6INK4a Mutationen bei familiären und sporadischen 8
Melanomen
1.2.3 Mehrstufen Onkogenese beim malignen Melanom 12
1.3 Methoden zur Darstellung von Mutationen in malignen Tumoren 14
1.3.1 Methoden zur Darstellung von chromosomalen Aberrationen 15
1.3.1.1 Zytogenetische Analyse 15
1.3.1.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Analyse 17
1.3.1.3 Southern Blot Analyse 18
1.3.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) basierte Methoden zur Darstellung 19
von Punktmutationen, Deletionen und Amplifikationen
1.3.2.1 DNA Sequenzierung 22
1.3.2.2 Single Strand Conformation Polymorphism Analyse 23
1.3.2.3 Competitive multiplex PCR 23
1.3.2.4 Arbitrarily primed PCR 24
2. Problemstellung und Zielsetzung 27
3. Material und Methoden 28
3.1 Patientenmaterial 28
3.2 Methoden 29
3.2.1 DNA Extraktion und Reinigung 29
3.2.2 Gel Elektrophorese von DNA in Agarose Gelen 31
3.2.3 Polymerasekettenreaktion 32
3.2.3.1 Competitive multiplex PCR 34
3.2.3.2 Arbitrarily primed PCR 37
3.2.4 Temperaturgradienten SSCP Gel Elektrophorese 40
3.2.5 Analyse im denaturierenden Polyacrylamidgel 43
3.3 Anhang: Geräte und Reagenzien 45
II
4. Ergebnisse 49
4.1 Competitive multiplex PCR 49
4.1.1 Optimierung der PCR Bedingungen und Darstellung homozygoter 49
Verluste
4.1.2 Mutationsnachweis im untersuchten Tumormaterial 53
4.2 Arbitrarily primed PCR 59
4.2.1 Optimierung der PCR Bedingungen 59
4.2.2 Mutationsnachweis im untersuchten Tumormaterial 64
5 Diskussion 68
6 Zusammenfassung 73
7 Literatur 75
Anhang: 88
I Abkürzungsverzeichnis 88
II Abbildungsverzeichnis 90
III Tabellenverzeichnis 91
IV Lebenslauf 92
V Danksagung 94
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das maligne Melanom 1
1.2 Molekulare Onkogenese des malignen Melanoms 6
1.2.1 Mechanismen der molekularen Onkogenese 6
1.2.2 CDKN2A/pl6INK4a Mutationen bei familiären und sporadischen 8
Melanomen
1.2.3 Mehrstufen Onkogenese beim malignen Melanom 12
1.3 Methoden zur Darstellung von Mutationen in malignen Tumoren 14
1.3.1 Methoden zur Darstellung von chromosomalen Aberrationen 15
1.3.1.1 Zytogenetische Analyse 15
1.3.1.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Analyse 17
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1.3.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) basierte Methoden zur Darstellung 19
von Punktmutationen, Deletionen und Amplifikationen
1.3.2.1 DNA Sequenzierung 22
1.3.2.2 Single Strand Conformation Polymorphism Analyse 23
1.3.2.3 Competitive multiplex PCR 23
1.3.2.4 Arbitrarily primed PCR 24
2. Problemstellung und Zielsetzung 27
3. Material und Methoden 28
3.1 Patientenmaterial 28
3.2 Methoden 29
3.2.1 DNA Extraktion und Reinigung 29
3.2.2 Gel Elektrophorese von DNA in Agarose Gelen 31
3.2.3 Polymerasekettenreaktion 32
3.2.3.1 Competitive multiplex PCR 34
3.2.3.2 Arbitrarily primed PCR 37
3.2.4 Temperaturgradienten SSCP Gel Elektrophorese 40
3.2.5 Analyse im denaturierenden Polyacrylamidgel 43
3.3 Anhang: Geräte und Reagenzien 45
II
4. Ergebnisse 49
4.1 Competitive multiplex PCR 49
4.1.1 Optimierung der PCR Bedingungen und Darstellung homozygoter 49
Verluste
4.1.2 Mutationsnachweis im untersuchten Tumormaterial 53
4.2 Arbitrarily primed PCR 59
4.2.1 Optimierung der PCR Bedingungen 59
4.2.2 Mutationsnachweis im untersuchten Tumormaterial 64
5 Diskussion 68
6 Zusammenfassung 73
7 Literatur 75
Anhang: 88
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