Mechanismus der Phenylalanin Ammoniak-Lyase-Reaktion: Lokalisierung und Funktion der prosthetischen Gruppe Dehydroalanin
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
2.
THEORIE
UND
AUFGABENSTELLUNG
2
2.1
VORKOMMEN
VON
PAL
2
2.2
DIE
ROLLE
VON
PAL
IM
METABOLISMUS
3
2.3
ALLGEMEINE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PAL
4
2
4
SUCHE
NACH
DEM
AKTIVEN
ZENTRUM
VON
PAL
4
2.5
DIE
WICHTIGSTEN
INHIBITOREN
VON
PAL
5
2.6
ENTWICKLUNG
DES
MECHANISMUS
VON
PAL
UND
HISTIDASE
6
AUFGABENSTELLUNG
11
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
12
3.1
MATERIAL
UND
BEZUGSQUELLEN
12
3.1.1
GERAETE
UND
HILFSMITTEL
12
3.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
13
3.1.3
CHEMIKALIEN
13
3.14
KITS
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN
15
3.1
5
ENZYME
15
3.1.5.1
RESTRIKTIONSENZYME
16
3.1.5
2
WEITERE
ENZYME
(SOWEIT
NICHT
UNTER
3.1.5
AUFGEFUEHRT)
16
3.1.6
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
SEQUENZIERUNGEN
UND
MUTAGENESEN
16
3.1.7
BAKTERIENSTAEMME,
VEKTOREN
UND
DNA
17
3.1.8
RADIOCHEMIKALIEN
18
3
.2
MEDIEN,
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
18
3.2.1
KULTURMEDIEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHES
ARBEITEN
18
3.2.2
REAKTIONSPUFFER
FUER
NUKLEINSAEUREN
20
3.2
3
PUFFER
FUER
PLASMIDISOLIERUNGEN
20
3.2
4
PUFFER
FUER
ELEKTROPHORESE
21
3.2.5
PUFFER
FUER
WESTEM-BLOTTING
21
3.2.6
PUFFER
FUER
DIE
PROTEINTRENNUNG
22
3.2.7
LOESUNGEN
ZUR
HERSTELLUNG
EINES
SEQUENZIERGELS
22
3.2.8
STAMMLOESUNGEN
23
3.3
METHODEN
24
3.3
1
STERILTECHNIK
24
3.3.2
MIKROBIOLOGISCHE
ARBEITSTECHNIKEN
24
3
3.2.1
ZELLAUSSTRICH
VON
GLYCERINKULTUREN
AUF
AGARPLATTEN
24
3.3.2.2
ANSETZEN
EINER
UEBEMACHTKULTUR
24
3.3
2.3
ANFERTIGEN
EINER
GLYCERINKULTUR
25
3.3.3
DNA-RELEVANTE
ARBEITSTECHNIKEN
25
3.3
3.1
INFEKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
BAKTERIOPHAGEN
25
3.3.3.2
PRAEPARATION
KLEINERER
MENGEN
AN
PLASMID-DNA
26
3.3.3.3
QIA
PREP-SPIN
"MINI-PREP"
26
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.34
PRAEPARATION
GROSSER
MENGEN
AN
PLASMID-DNA
26
3
3
3
5
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
DEM
AGAROSEGEL
27
3.3.3.6
EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
MIT
PHENOL/CHLOROFORM
27
3.3.37
ETHANOLFALLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
3.3
3.8
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAUREKONZENTRATIONEN
28
3.3
3.9
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
28
3
3
3
10
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
3
3.3.11
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
NACH
ECKSTEIN
29
3.3
3.12
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
NACH
DER
CHAMELEON-KIT
METHODE
31
3.3.3.13
DIE
DNA-SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
ENZYM
SEQUENASE
32
3.3.3.14
SEQUENZIEREN
MIT
DEM
ENZYM
TAQ
DNA
POLYMERASE
34
3.3.3.15
DOPPELSTRANGSEQUENZIERUNG
MIT
DEM
F-MOL
KIT
35
3.3.3.16
DOPPELSTRANGSEQUENZIERUNG
MITTELS
DENATURIERUNG
36
3.3.3.17
HERSTELLUNG
VON
SEQUENZIERGELEN
36
3.3.3.18
DIE
PAGE-ELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
SEQUENZIERUNGSREAKTIONEN
37
3.3.3.19
AUTORADIOGRAPHIE
VON
SEQUENZIERGELEN
37
3.3
3
20
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
38
3.3.3
21
TRANSFORMATION
VON
DNA
IN
KOMPETENTE
BAKTERIEN
38
3
3.3.22
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
E.COLI
SURE,
BL
21
BZW.
TG1
ZELLEN
38
3.3.3.23
TRANSFORMATION
VON
DNA
IN
HEFEZELLEN
39
3.3.3.24
DIE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
40
3.3
3.25
UEBEREXPRESSION
VON
PROTEIN
IM
EXPRESSIONSSYSTEM
E.COLI
BL21/PT7.7
40
3.3.4
PROTEINCHEMISCHE
ARBEITEN
41
3.3.4.1
ZELLAUFSCHLUSS
DURCH
ULTRASCHALL
41
3.3.4.2
ZELLAUFSCHLUSS
AUS
KLEINEN
VOLUMINA
41
3
3.4
2
1
BAKTERIENZELLEN
41
3.3.4
2.2
HEFEZELLEN
41
3.3
4.3
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
42
3
3.4.4
PROTEINKONZENTRIERUNG
UND
PROTEINBESTIMMUNG
43
3.3.4.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELEIEKTROPHORESE
44
3.3
4.6
TRANSFER
VON
PROTEINEN
IM
WESTEM-BLOT-VERFAHREN
45
3.3.4.7
DARSTELLUNG
FILTERGEBUNDENER
PROTEINE
MITTELS
IMMUNO
LOGISCHER
DETEKTION
46
3.3.4.8
UNTERSUCHUNG
ZUR
SPALTUNG
VON
ENZYMEN
AN
ATP
BINDUNGSSTELLEN
DURCH
INKUBATION
MIT
ASCORBAT
46
3.3.49
AKTIVITATSTEST
AUF
PHENYLALANIN
AMMONIAK-LYASE
47
3.3.4.10
KINETISCHE
MESSUNGEN
AN
PHENYLALANIN
AMMONIAK-LYASE
47
3.3.4.11
INHIBITION
VON
PHENYLALANIN
AMMONIAK-LYASE
49
3.3.4.12
KRISTALLISATION
VON
PHENYLALANIN
AMMONIAK-LYASE
49
4.
ERGEBNISSE
50
4.1
AMINOSAEURESEQUENZVERGLEICH
VON
PAL
AUS
PETROSEHNUM
CRISPUM
MIT
12
VERSCHIEDENEN
PHENYLALANIN AMMONIAK-LYASEN
UND
6
VERSCHIEDENEN
HISTIDASEN
50
4.2
EINFUEHRUNG
VON
PAL
IN
DAS
EXPRESSIONSSYSTEM
PTL.LLE.COU
BL21(DE3)
50
INHALTSVERZEICHNIS
4.2
1
EINFUEHRUNG
DER
NDE
1
-SCHNITTSTELLE
AM
5'-ENDE
DES
PAL-GENES
DURCH
MUTAGENESE
NACH
ECKSTEIN
51
4.2.2
ZUSAMMENFUEHRUNG
DER
PAL-FRAGMENTE
IM
PBS-PLASMID
UND
EINKLONIERUNG
IN
DEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PT7.7
51
4.3
OPTIMIERUNG
DER
EXPRESSION
VON
PAL
IM
EXPRESSIONSSYSTEM
PT7.7/E.COTF
BL21(DE3)
52
4.3.1
FESTLEGUNG DER
ZEITSPANNE
DER
INDUKTION
52
4.3.2
FESTLEGUNG
DES
ZEITPUNKTES
DER
INDUKTION
53
4.3.3
EINFLUSS
VON
PHENYLALANIN
IM
MEDIUM
AUF
DIE
AUSBEUTE
AN
PAL
53
4.4
EXPRESSION
VON
PAL
IM
SYSTEM
PYEURA
3
IN
HEFE
W303-1B
54
4.5
REINIGUNG
DER
EXPRIMIERTEN
PHENYLALANIN
AMMONIAK-LYASE
55
4.6
MUTATION
VON
SERIN
202
UND
SERIN
209
ZU
ALANIN
57
4.7
ZUSAMMENFUEHRUNG
DER
MUTIERTEN
5
-PAL-FRAGMENTE
IM
PBS-PLASMID
UND
EINKLONIERUNG
IN
DEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PT7.7
58
4.8
EXPRESSION
VON
MUTS202A
UND
MUTS209A
IN
E.
COLI
BL21-ZELLEN
58
4.9
CHARAKTERISIERUNG
VON
WILDTYP-PAL,
MUTANTE
S202A
UND
S209A
UEBER
KYY
UND
VMAX-WERTE
59
4.10
AUSTAUSCH
DES
SERINS
202
DURCH
CYSTEIN
UND
THREONIN
UND
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
KATALYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PAL
61
4.11
UMSETZUNG
DER
DEHYDROALANIN FREIEN
MUTANTEN
S202A
UND
S202T,
NABH
REDUZIERTEN
WTPAL
UND
WTPAL
MIT
NOJ-PHENYLALANIN
63
4
12
UMSETZUNG
VON
DL-M-TYROSIN
UND
L-TYROSIN
MIT
WILDTYP-PAL
65
4.13
UMSETZUNG
VON
WTPAL
MIT
DL-M,M-DIMETOXYPHENYLALANIN
66
4.14
INHIBITIONSKINETISCHE
MESSUNGEN
66
4.14.1
INHIBITION
MIT
NOZ-ZIMTSAURE
66
4.142
INHIBITION MIT
M-CUMARSAEURE
67
4.14
3
INHIBITION MIT
M-KRESOL
68
4
14.4
INHIBITION
MIT
EINER
MISCHUNG
AUS
M-KRESOL
UND
GLYCIN
69
4.15
HERSTELLUNG
VON
HAL/PAL-HYBRIDEN UND
DEREN
CHARAKTERISIERUNG
69
4.16
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BILDUNG
DES
DEHYDROALANINS
70
4.16.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
PROTONIERUNG
VON
SERIN
70
4.16.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SERIN
71
4.16
2
1
SEQUENZVERGLEICH
VON
PAL
UND
HAL
MIT
VERSCHIEDENEN
KINASEN
71
4.16.2.2
REAKTION
VON
ASCORBAT/ATP
MIT
PAL
72
4.17
KRISTALLISATION
VON
PAL
72
5.
DISKUSSION
73
AUSBLICK
80
6.
ZUSAMMENFASSUNG
82
7.
LITERATUR
83 |
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