Quantifizierung genotoxischer Schäden an humanen Schleimhautzellen des oberen Aerodigestivtraktes:
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|---|---|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 4
1.1 Mutagenese und Kanzerogenese von Tumoren 4
1.2 Karzinome des oberen Aerodigestivtraktes 6
1.2.1 Epidemiologie 8
1.2.2 Endogene Risikofaktoren 9
1.2.2.1 DNA-Reparatur 10
1.2.3 Exogene Risikofaktoren 11
1.2.4 Schädigung der Erbsubstanz durch Fremdstoffe 13
1.2.4.1 Benzo[a]pyren-diol-epoxid (BPDE) 14
1.2.4.2 N-Nitrosodiethylamin (NDEA) 16
1.2.4.3 N-Methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidin(MNNG) 17
1.3 Darstellung von Genotoxizität 18
1.3.1 Die alkalische Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) 18
1.3.2 Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 20
1.4 Zielsetzung 23
2 Material und Methoden 24
2.1 Patienten 24
2.7.7 Tonsillenschleimhaut von tumorfreien Spendern 24
2.1.2 Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillen-Karzinom 24
2.1.3 Laryngeale Schleimhaut von Spendern mit Larynx-Karzinom 24
2.1.4 Spender von Tonsillengewebe für Comet/Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung 25
2.2 Materialien und Geräte 25
2.2.7 Testsubstanzen 25
2.2.2 Färbungen und Chromosomensonden 26
2.2.3 Chemikalien und Reagenzien 26
2.2.4 Herstellung der Gebrauchslösungen 26
2.2.5 Verbrauchsmaterialien 29
2.2.6 Geräte und Auswertungsprogramme 29
2.3 Die alkalische Mikrogelelektrophorese 31
2.3.1 Präparation des Testgewebes 31
2.3.2 Gewinnen von Einzelzellen 32
2.3.3 Bestimmen der Zellzahl und Vitalität 32
2.3.4 Präparation der Xenobiotika 32
2.3.5 Inkubation mit den Fremdstoffen 33
2.3.6 Reparatur 33
2.3.7 Aufbringen der Zellen auf Objektträger 34
2.3.8 Lyse der zellulären Membranen und Alkalische Elektrophorese 34
2.3.9 Färbung und digitale Auswertung 35
2.3.10 Statistische Ergebnisanalyse 35
2.4 Comet Assay - Fluoreszenz in situ Hybridisierung 37
2.4.1 Auswahl, Entnahme und Vorbereitung der Proben 37
2.4.2 Vorbereitung und Hybridisierung der DNA-Sonden 37
2.4.3 Auswaschen ungebundener DNA-Sonden 37
2.4.4 Gegenfarben der zellulären DNA 38
1
Einleitung
2.4.5 Datenspeicherung und digitale Auswertung 38
2.4.6 Quantifizierung der Schäden mit dem MCTM 39
3 Ergebnisse 40
3.1 Zellvitalitäten 40
3.2 Ergebnisse des Comet Assay 40
3.2.1 DNA-Schädigung nach Fremdstoffinkubation 41
3.2.1.1 DNA-Schädigung an Tonsillenschleimhaut von Kontrollpatienten 41
3.2.1.2 DNA-Schädigung an Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom 42
3.2.1.3 DNA-Schädigung an Larynx-Schleimhaut von Spendern mit Larynx-Karzinom 43
3.2.2 Vergleich gewebespezifischer Mutagensensitivität 44
3.2.2.1 Mutagensensitivität von Tonsillenschleimhaut gesunder Spendern und von Spendern
mit Tonsillenkarzinom 44
3.2.2.2 Mutagensensitivtät von Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom
und von Larynxschleimhaut von Spendern mit Larynxkarzinom 45
3.2.3 DNA-Reparatur nach Fremdstoffexposition 46
3.2.3.1 DNA-Reparatur von Tonsillenschleimhaut tumorfreier Spender 46
3.2.3.2 DNA-Reparatur tonsillarer Schleimhautzellen von Spendern mit Tonsillenkarzinom 47
3.2.3.3 DNA-Reparatur laryngealer Schleimhautzellen von Spendern mit Larynx-Karzinom 48
3.2.4 Vergleich der DNA-Reparatur verschiedener Kollektive 49
3.2.4.1 DNA-Reparaturfähigkeit von Tonsillenschleimhaut von gesunden Spendern und
Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom 49
3.2.4.2 DNA-Reparaturfähigkeit von Tonsillenschleimhaut von Spendern mit
Tonsillenkarzinom und Larynxschleimhaut von Spendern mit Larynxkarzinom 50
3.3 Ergebnisse von Comet/FISH 51
3.3.1 DNA-Schädigung durch BPDE 51
3.3.1.1 DNA-Schädigung an Chromosom 1 52
3.3.1.2 DNA-Schädigung an Chromosom 3 53
3.3.1.3 DNA-Schädigung an Chromosom 5 54
3.3.1.4 DNA-Schädigung an Chromosom 8 55
3.3.2 Vergleich der untersuchten Chromosomen 56
4 Diskussion 58
4.1 Auswahl und Epidemiologie des Spenderkollektivs 58
4.2 Diskussion des Testgewebes 59
4.3 Diskussion der Methoden 59
4.3.1 Der Comet Assay 60
4.3.2 Die Kombination Comet/FISH 62
4.3.2.1 Datengewinnung 63
4.3.2.2 Quantifizierung von Genschäden mit dem Munich Chromosomal Tail Moment 64
4.4 Diskussion der Testsubstanzen 65
4.4.1 BPDE 65
4.4.2 NDEA 66
4.5 Darstellung von DNA-Schäden mit dem Comet Assays 68
4.5.1 Diskussion der genotoxischen Schädigung 68
4.5.1.1 DNA-Schädigung bei den Spendergruppen 68
4.5.2 Vergleich der DNA-Schädigung der einzelnen Spendergruppen 69
4.5.2.1 Vergleich der DNA-Schädigung von Spendern mit und ohne Tonsillen-Karzinom 69
2
Einleitung
4.5.2.2 Vergleich der DNA-Schädigung von Spendern mit Karzinom der Tonsille und des
Larynx 70
4.5.3 Diskussion der DNA-Reparatur 70
4.5.3.1 DNA-Reparatur der einzelnen Spendergruppen 71
4.5.4 Vergleich der DNA-Reparatur der einzelnen Spendergruppen 72
4.5.4.1 Vergleich der DNA-Repartur von Tonsillengewebe von Patienten mit und ohne
Tonsillenkarzinom 73
4.5.4.2 Vergleich der DNA-Repartur von Patienten mit Tonsillenkarzinom und
Larynxkarzinom 73
4.6 Darstellung von DNA-Schäden mit Comet/FISH 74
4.6.1 Diskussion der Schädigung durch BPDE 74
4.6.2 Vergleich der chromosomalen Schädigung 75
4.7 Ausblick 76
5 Zusammenfassung 77
6 Literatur 79
2 Anhang 89
7.1 Anamnesen der Patienten 89
7.1.1 Tumorfreie Spender von Tonsillengewebe 89
7.1.2 Spender von Tonsillenschleimhaut mit Tonsillenkarzinom 90
7.1.3 Spender von Larynxschleimhaut mit Larynxkarzinom 90
7.1.4 Spender von tumorfreier Tonsillenschleimhaut für die Kombination Comet/FISH 91
7.2 Verwendete Abkürzungen 92
7.3 Publikationen aus der Arbeit 93
7.4 Curriculum Vitae 94
3
|
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Einleitung
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 4
1.1 Mutagenese und Kanzerogenese von Tumoren 4
1.2 Karzinome des oberen Aerodigestivtraktes 6
1.2.1 Epidemiologie 8
1.2.2 Endogene Risikofaktoren 9
1.2.2.1 DNA-Reparatur 10
1.2.3 Exogene Risikofaktoren 11
1.2.4 Schädigung der Erbsubstanz durch Fremdstoffe 13
1.2.4.1 Benzo[a]pyren-diol-epoxid (BPDE) 14
1.2.4.2 N-Nitrosodiethylamin (NDEA) 16
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1.3 Darstellung von Genotoxizität 18
1.3.1 Die alkalische Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) 18
1.3.2 Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 20
1.4 Zielsetzung 23
2 Material und Methoden 24
2.1 Patienten 24
2.7.7 Tonsillenschleimhaut von tumorfreien Spendern 24
2.1.2 Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillen-Karzinom 24
2.1.3 Laryngeale Schleimhaut von Spendern mit Larynx-Karzinom 24
2.1.4 Spender von Tonsillengewebe für Comet/Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung 25
2.2 Materialien und Geräte 25
2.2.7 Testsubstanzen 25
2.2.2 Färbungen und Chromosomensonden 26
2.2.3 Chemikalien und Reagenzien 26
2.2.4 Herstellung der Gebrauchslösungen 26
2.2.5 Verbrauchsmaterialien 29
2.2.6 Geräte und Auswertungsprogramme 29
2.3 Die alkalische Mikrogelelektrophorese 31
2.3.1 Präparation des Testgewebes 31
2.3.2 Gewinnen von Einzelzellen 32
2.3.3 Bestimmen der Zellzahl und Vitalität 32
2.3.4 Präparation der Xenobiotika 32
2.3.5 Inkubation mit den Fremdstoffen 33
2.3.6 Reparatur 33
2.3.7 Aufbringen der Zellen auf Objektträger 34
2.3.8 Lyse der zellulären Membranen und Alkalische Elektrophorese 34
2.3.9 Färbung und digitale Auswertung 35
2.3.10 Statistische Ergebnisanalyse 35
2.4 Comet Assay - Fluoreszenz in situ Hybridisierung 37
2.4.1 Auswahl, Entnahme und Vorbereitung der Proben 37
2.4.2 Vorbereitung und Hybridisierung der DNA-Sonden 37
2.4.3 Auswaschen ungebundener DNA-Sonden 37
2.4.4 Gegenfarben der zellulären DNA 38
1
Einleitung
2.4.5 Datenspeicherung und digitale Auswertung 38
2.4.6 Quantifizierung der Schäden mit dem MCTM 39
3 Ergebnisse 40
3.1 Zellvitalitäten 40
3.2 Ergebnisse des Comet Assay 40
3.2.1 DNA-Schädigung nach Fremdstoffinkubation 41
3.2.1.1 DNA-Schädigung an Tonsillenschleimhaut von Kontrollpatienten 41
3.2.1.2 DNA-Schädigung an Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom 42
3.2.1.3 DNA-Schädigung an Larynx-Schleimhaut von Spendern mit Larynx-Karzinom 43
3.2.2 Vergleich gewebespezifischer Mutagensensitivität 44
3.2.2.1 Mutagensensitivität von Tonsillenschleimhaut gesunder Spendern und von Spendern
mit Tonsillenkarzinom 44
3.2.2.2 Mutagensensitivtät von Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom
und von Larynxschleimhaut von Spendern mit Larynxkarzinom 45
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3.2.3.1 DNA-Reparatur von Tonsillenschleimhaut tumorfreier Spender 46
3.2.3.2 DNA-Reparatur tonsillarer Schleimhautzellen von Spendern mit Tonsillenkarzinom 47
3.2.3.3 DNA-Reparatur laryngealer Schleimhautzellen von Spendern mit Larynx-Karzinom 48
3.2.4 Vergleich der DNA-Reparatur verschiedener Kollektive 49
3.2.4.1 DNA-Reparaturfähigkeit von Tonsillenschleimhaut von gesunden Spendern und
Tonsillenschleimhaut von Spendern mit Tonsillenkarzinom 49
3.2.4.2 DNA-Reparaturfähigkeit von Tonsillenschleimhaut von Spendern mit
Tonsillenkarzinom und Larynxschleimhaut von Spendern mit Larynxkarzinom 50
3.3 Ergebnisse von Comet/FISH 51
3.3.1 DNA-Schädigung durch BPDE 51
3.3.1.1 DNA-Schädigung an Chromosom 1 52
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3.3.1.3 DNA-Schädigung an Chromosom 5 54
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3.3.2 Vergleich der untersuchten Chromosomen 56
4 Diskussion 58
4.1 Auswahl und Epidemiologie des Spenderkollektivs 58
4.2 Diskussion des Testgewebes 59
4.3 Diskussion der Methoden 59
4.3.1 Der Comet Assay 60
4.3.2 Die Kombination Comet/FISH 62
4.3.2.1 Datengewinnung 63
4.3.2.2 Quantifizierung von Genschäden mit dem Munich Chromosomal Tail Moment 64
4.4 Diskussion der Testsubstanzen 65
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4.5.1 Diskussion der genotoxischen Schädigung 68
4.5.1.1 DNA-Schädigung bei den Spendergruppen 68
4.5.2 Vergleich der DNA-Schädigung der einzelnen Spendergruppen 69
4.5.2.1 Vergleich der DNA-Schädigung von Spendern mit und ohne Tonsillen-Karzinom 69
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Einleitung
4.5.2.2 Vergleich der DNA-Schädigung von Spendern mit Karzinom der Tonsille und des
Larynx 70
4.5.3 Diskussion der DNA-Reparatur 70
4.5.3.1 DNA-Reparatur der einzelnen Spendergruppen 71
4.5.4 Vergleich der DNA-Reparatur der einzelnen Spendergruppen 72
4.5.4.1 Vergleich der DNA-Repartur von Tonsillengewebe von Patienten mit und ohne
Tonsillenkarzinom 73
4.5.4.2 Vergleich der DNA-Repartur von Patienten mit Tonsillenkarzinom und
Larynxkarzinom 73
4.6 Darstellung von DNA-Schäden mit Comet/FISH 74
4.6.1 Diskussion der Schädigung durch BPDE 74
4.6.2 Vergleich der chromosomalen Schädigung 75
4.7 Ausblick 76
5 Zusammenfassung 77
6 Literatur 79
2 Anhang 89
7.1 Anamnesen der Patienten 89
7.1.1 Tumorfreie Spender von Tonsillengewebe 89
7.1.2 Spender von Tonsillenschleimhaut mit Tonsillenkarzinom 90
7.1.3 Spender von Larynxschleimhaut mit Larynxkarzinom 90
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| spelling | Schuller, Paul Reinhart 1977- Verfasser (DE-588)136280455 aut Quantifizierung genotoxischer Schäden an humanen Schleimhautzellen des oberen Aerodigestivtraktes von Paul Reinhart Schuller 2008 94 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 2008 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:19-90233 http://edoc.ub.uni-muenchen.de/9023/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-90233 Resolving-System HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=016767964&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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