Klonierung und Transkriptionsregulation des Kolligin-Promotors der Ratte:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 7
LL Kollagen 7
t2. Das kardiale Kollagen Netzwerk. 7
1.2.1. Funktion 7
1.2.2. Struktur 8
1.2.3. Regulation 9
L3. Myokardiale Verandeningen nach Ischämie und Infarkt 9
1.3.1. Ventrikulare Veränderungen 9
1.3.2. Spätfolgen 10
1.3.3. Folgen einer Ischämie auf die kollagene Matrix 11
1.4. Kolligin 12
1.4.1. Natur des Kolligin 12
1.4.2. Die Rolle des Kolligms im Kollagen Stoffwechsel 12
L5. Transkriptionsregulation und invohrierte Elemente 13
1.5.1. Übersicht über die Regulation der Transkription in Eukaryonten 13
1.5.2. Transkriptionselemente 15
1.5.3. SP1 und Krüppel like Faktoren 17
1.6. Aufgabenstellung 21
2. Material und Methoden 22
2.L Material 22
2.1.1. Chemikalien 22
2.1.2. Geräte 23
2.1.3. Bakterien und Zellen 24
2.1.4. Enzyme, Koenzyme und DNA Standards 25
2.1.5. Kit s 25
2.1.6. Radiochemikalien 20
2.1.7. Oligonukleonde 26
2.1.8. Puffer, Lösungen, Nährmedien 27
2.1.9. Software 28
2.2. Methoden 29
2.2.1. Nukleinsäure Techniken 29
2.2.1.1. Amplifikation des Promotors 29
2.2.1.2. Amplifikation der Subklone 29
2.2.1.3. PCR zum Nachweis eines Inserts und dessen Einbaurichtung 30
2.2.1.4. Elektrophorese 30
2.2.1.5. DNA Isolation aus Agarose Gelen 31
2.2.2. Vektorkonstruktion und Klonierung . . 31
2.Z2.1. Restnktionsverdau 31
2.2.2.2. Modifikation der Restriktionstermini 31
2.2.2.3. Phenolextraknon 32
2.2.2.4. Ligation 32
2.Z2.5. Transformation 33
2.2.2.6. Herstellung kompetenter Zellen 34
2.Z2.7. Koloniehybridisierung 34
2.2.3. Sequenzierung 35
2.2.4. Synthese und Identifizierung der Subklone 36
2.2.5. Zellkultur 38
2.2.5.1. NIH/3T3 Fibroblasten 38
2.2.5.2. Primäre Kardbfibroblasten 39
2.2.5.3. Pissige der Zellen 40
2.2.6. Transfektion *
2.Z6.1. TransFast™ (Promega) ^
2.Z6.Z Effecttne™ (Qiagen) 4t
5
2.2.6.3. FuGene™ (Bochringer) 41
2.2.6.4. Transfektionsstudic mit pEGFP N2, Ko Transfektion und Luminomerhe 42
2.2.7. DNA Protein Wechsehv)rkungen 43
2.2.7.1. Kernextraktpräparation 43
2.2.7.2. Sondenmarkietung 44
2.2.7.3. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 44
2J. Plasmide 46
2.3.1. pGEM T Vektor (Promega) 46
2.3.2. pGL3 Luciferase Reporter Vektor 47
2.3.3. pRL CMV Vektor 48
2.3.4. pEGFP N2 Vektor 49
2.3.5. Plasmide mit Promotorfragmenten 50
3. Ergebnisse 51
3.L Amplifikadon und Kloniemng 51
3.1.1. Amplifikation der 5 flankierenden Region 51
3.1.2. Transfekbon 56
3.2. Charakterisienuuz des Protnotors.... . 58
3.2.1. Luminometrie 58
3.2.2. Untersuchungen von DNA Protein Wechsdwirkungen 61
4. Diskussion 65
4.1. Kloniening des Kolligin Promotors 65
4.2. Charakterisierung des Promoters ..*5
4_J. Akriviiittbesdmmung des Promoters 69
4.4. Transfektion. 70
4.5. Regulation von Kollagen, Kolligin und SP1 72
5. Zusflmmciifiuistmg 77
6. Literaturverzeichnis 81
7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95
8. Lebenslauf %
9. Danksagung 97
1 6
|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 7
LL Kollagen 7
t2. Das kardiale Kollagen Netzwerk. 7
1.2.1. Funktion 7
1.2.2. Struktur 8
1.2.3. Regulation 9
L3. Myokardiale Verandeningen nach Ischämie und Infarkt 9
1.3.1. Ventrikulare Veränderungen 9
1.3.2. Spätfolgen 10
1.3.3. Folgen einer Ischämie auf die kollagene Matrix 11
1.4. Kolligin 12
1.4.1. Natur des Kolligin 12
1.4.2. Die Rolle des Kolligms im Kollagen Stoffwechsel 12
L5. Transkriptionsregulation und invohrierte Elemente 13
1.5.1. Übersicht über die Regulation der Transkription in Eukaryonten 13
1.5.2. Transkriptionselemente 15
1.5.3. SP1 und Krüppel like Faktoren 17
1.6. Aufgabenstellung 21
2. Material und Methoden 22
2.L Material 22
2.1.1. Chemikalien 22
2.1.2. Geräte 23
2.1.3. Bakterien und Zellen 24
2.1.4. Enzyme, Koenzyme und DNA Standards 25
2.1.5. Kit's 25
2.1.6. Radiochemikalien 20
2.1.7. Oligonukleonde 26
2.1.8. Puffer, Lösungen, Nährmedien 27
2.1.9. Software 28
2.2. Methoden 29
2.2.1. Nukleinsäure Techniken 29
2.2.1.1. Amplifikation des Promotors 29
2.2.1.2. Amplifikation der Subklone 29
2.2.1.3. PCR zum Nachweis eines Inserts und dessen Einbaurichtung 30
2.2.1.4. Elektrophorese 30
2.2.1.5. DNA Isolation aus Agarose Gelen 31
2.2.2. Vektorkonstruktion und Klonierung .'. 31
2.Z2.1. Restnktionsverdau 31
2.2.2.2. Modifikation der Restriktionstermini 31
2.2.2.3. Phenolextraknon 32
2.2.2.4. Ligation 32
2.Z2.5. Transformation 33
2.2.2.6. Herstellung kompetenter Zellen 34
2.Z2.7. Koloniehybridisierung 34
2.2.3. Sequenzierung 35
2.2.4. Synthese und Identifizierung der Subklone 36
2.2.5. Zellkultur 38
2.2.5.1. NIH/3T3 Fibroblasten 38
2.2.5.2. Primäre Kardbfibroblasten 39
2.2.5.3. Pissige der Zellen 40
2.2.6. Transfektion *
2.Z6.1. TransFast™ (Promega) ^
2.Z6.Z Effecttne™ (Qiagen) 4t
5
2.2.6.3. FuGene™ (Bochringer) 41
2.2.6.4. Transfektionsstudic mit pEGFP N2, Ko Transfektion und Luminomerhe 42
2.2.7. DNA Protein Wechsehv)rkungen 43
2.2.7.1. Kernextraktpräparation 43
2.2.7.2. Sondenmarkietung 44
2.2.7.3. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 44
2J. Plasmide 46
2.3.1. pGEM T Vektor (Promega) 46
2.3.2. pGL3 Luciferase Reporter Vektor 47
2.3.3. pRL CMV Vektor 48
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2.3.5. Plasmide mit Promotorfragmenten 50
3. Ergebnisse 51
3.L Amplifikadon und Kloniemng 51
3.1.1. Amplifikation der 5' flankierenden Region 51
3.1.2. Transfekbon 56
3.2. Charakterisienuuz des Protnotors. . 58
3.2.1. Luminometrie 58
3.2.2. Untersuchungen von DNA Protein Wechsdwirkungen 61
4. Diskussion 65
4.1. Kloniening des Kolligin Promotors 65
4.2. Charakterisierung des Promoters .*5
4_J. Akriviiittbesdmmung des Promoters 69
4.4. Transfektion. 70
4.5. Regulation von Kollagen, Kolligin und SP1 72
5. Zusflmmciifiuistmg 77
6. Literaturverzeichnis 81
7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95
8. Lebenslauf %
9. Danksagung 97
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