Die Rolle pflanzlicher Zuckertransportproteine beim Assimilattransfer in das Nährzellensystem von Heterodera schachtii:
Gespeichert in:
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| Veröffentlicht: |
2002
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_
_
I
NHALT
I
NHALT
1
E
INLEITUNG
.
I
DER
ENTWICKLUNGSZYKLUS
VON
HETERODERA
SCHACHTII
.
1
DAS
SYNCYTIUM
-
EIN
NEUGESTALTETES
PFLANZLICHES
GEWEBE
.
3
DIFFERENTIELLE
GENEXPRESSION
IN
DER
NFS
.
4
DIE
AKTIVIERUNG
REGULATORISCHER
GENE
.
4
EXKURS
ZUR
BETEILIGUNG
VON
PHYTOHORMONEN
.
5
DIE
REGULATION
DES
OSMOTISCHEN
POTENTIALS
.
6
DIE
AKTIVIERUNG
VON
GENEN
DES
ENERGIESTOFFWECHSELS
.
8
ZIELSETZUNG
.
10
2
E
RGEBNISSE
.
12
2.1
DER
MONOSACCHARIDTRANSPORTER
ATSTP6
.
12
2.1.1
KLONIERUNG
DER
ATSTP6
CDNA
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
12
2.1.2
KOMPLEMENTATION
VON
HEXOSETRANSPORT-DEFIZIENTEN
HEFEZELLEN
DURCH
ATSTP6
.
14
2.1.3
SUBSTRATAUFHAHME-TESTS
.
15
2.1.3.1
BESTIMMUNG
DER
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
15
2.1.3.2
EINFLUSS
VON
HEMMSTOFFEN
.
16
2.1.3.3
BESTIMMUNG
DES
KM-WERTES
FUER
GLUKOSE
.
17
2.1.4
ANALYSE
VON
ATSTP6
MUTANTEN
.
19
2.1.4.1
IDENTIFIZIERUNG
EINER
HOMOZYGOTEN
ATSTP6
INSERTIONSMUTANTE
.
19
2.1.4.2
PHAENOTYPISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
HOMOZYGOTEN
ARSTPOE-INSERTIONSMUTANTE
.
20
2.1.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISIERUNG
VON
ATSTPOE
.
21
2.1.5.1
ANALYSE
VON
ATSTPOE-PROMOTOR-GUS-PFLANZEN
.
22
2.1.5.2
IMMUNOLOKALISATION
DES
ATSTPOE-PROTEINS
.
23
2.1.5.2.1
HERSTELLUNG
UND
AFFINITAETSREINIGUNG
DES
ANTI-ATSTP6-ANTISERUMS
.
23
2.1.5.2.2
WESTERN
ANALYSEN
MIT
GEREINIGTEM
ANTI-ATSTP6-ANTISERUM
.
24
2.1.5.2.3
IMMUNOLOKALISATION
VON
ATSTPOE
IN
DUENNSCHNITTEN
VERSCHIEDENER
ARABIDOPSIS-GEWEBE
.
25
2.1.5.2.4
IMMUNOLOKALISATION
VON
ATSTPOE
IN
DER
INSERTIONSMUTANTE
EN27(2)
.
28
2.1.5.3
NACHWEIS
DES
ATSTP6
TRANSKRIPTS
DURCH
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
30
2.2
DER
MONOSACCHARIDTRANSPORTER
ATSTPLL
.
33
2.2.1
KLONIERUNG
VON
ATSTPLL
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.33
2.2.2
KOMPLEMENTATION
VON
HEXOSETRANSPORT-DEFIZIENTEN
HEFEZELLEN
DURCH
ATSTPLL
.
34
2.2.3
SUBSTRATAUFHAHME-TESTS
.
35
2.2.3.1
BESTIMMUNG
DER
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
35
2.2.3.2
EINFLUSS
VON
HEMMSTOFFEN
.
37
2.2.3.3
BESTIMMUNG
DES
KM-WERTES
FUER
GLUKOSE
.
37
.I
NHALT
.
2.3
DER
MONOSACCHARIDTRANSPORTER
ATSTP9
.
38
2.3.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINES
GENOMISCHEN
ATSTP9
KLONS
.
38
2.3.2
VORARBEITEN
ZUR
INUNUNOLOKALISATION
VON
ATSTP9
.
42
2.3.2.1
HERSTELLUNG
EINES
ANTI-ATSTP9-ANTISERUMS
.
42
2.3.2.2
WESTERN
ANALYSEN
MIT
DEM
ANTI-ATSTP9-ANTISERUM
.
42
2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INDUKTION
VON
ATSUC2
IN
SYNCYTIEN
VON
HETERODERA
SCHACHTII44
2.4.1
NACHWEIS
DES
ATSUC2
PROTEINS
IN
SYNCYTIEN
.
44
2.4.1.1
AFFINITAETSREINIGUNG
DES
ANTI-ATSUC2-ANTISERUMS
UND
SPEZIFITAETSNACHWEIS
.
44
2.4.1.2
SENSITIVITAET
DES
ANTI-ATSUC2-ANTISERUMS
GEGENUEBER
FIXANTIEN
.
45
2.4.1.3
INUNUNOLOKALISATION
DES
ATSUC2-PROTEINS
IN
HETERODERA-INSSZIERTEN
WURZELN.46
2.4.2
ANALYSE
DES
ATSUC2
PROMOTORS
.
49
2.4.2.1
GFP-EXPRESSION
IN
TRANSGENEN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
MIT
VERKUERZTEN
PROMOTORBEREICHEN
.
49
2.4.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
SYNCYTIUMSPEZIFITAET
DES
ATSUC2
PROMOTORFRAGMENTS
D
DURCH
EXPRESSION
EINES
CYTOTOXINS
.
52
2.4.2.2.1
HERSTELLUNG
DER
EXOTOXIN
A-KONSTRUKTE
.
52
2
A.2.2.2
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DER
EXOTOXIN
A-FRAGMENTE
IN
TRANSGENEN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
54
2.4.2.3
UNTERSUCHUNG
DES
ATSUC2
PROMOTORBEREICHS
ZWISCHEN
-462
UND
-225
.
55
2.4.2.3.1
HERSTELLUNG
VON
NEUEN
PROMOTOR-DELETIONSKONSTRUKTEN
.
56
2.4.2.3.2
GFP-EXPRESSION
DURCH
DEN
PROMOTORBEREICH
-462
BIS
-225
IN
TRANSGENEN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
57
2.4.2.3.3
GUS-EXPRESSION
DURCH
DEN
PROMOTORBEREICH
-462
BIS
-225
IN
TRANSGENEN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
59
3
D
ISKUSSION
------------------------------------------------------------------
60
DER
TRANSPORT
VON
MONOSACCHARIDEN
DURCH
ATSTPOE
UND
ATSTPL
1
.
61
POLLENSPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
ATSTP6
GENS
.
62
DIE
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
ATSUC2
IN
SYNCYTIEN
VON
HETERODERA
SCHACHTII
.
64
SYNCYTIENSPEZIFITAET
DES
ATSL/C2-PROMOTORS
.
65
4
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
72
4.1
MATERIAL
.
72
4.1.1
ORGANISMEN
.
72
4.1.1.1
BAKTERIENSTAEMME
.
72
4.1.1.2
HEFESTAEMME
.
72
4.1.1.3
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
73
4.1.2
VEKTOREN
.
74
4.1.3
CDNA-BANKEN
.
76
4.1.4
OLIGONUKLEOTIDE
.
76
4.1.5
ANTIKOERPER
.
78
4.1.6
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
78
4.1.7
GERAETE
.
79
4.1.8
LOESUNGEN
.
80
II
_
I
NHALT
4.1.9
ANZUCHTMEDIEN
.
84
4.1.9.1
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
84
4.1.9.2
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
HEFEN
.
85
4.1.9.3
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
ARABIDOPSIS
.
85
4.2
METHODEN
.
86
4.2.1
ANZUCHT
DER
ORGANISMEN
.
86
4.2.1.1
BAKTERIEN
UND
HEFEN
.
86
4.2.1.2
PFLANZEN
.
86
4.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
87
4.2.2.1
HERSTELLUNG
VON
DAUERKULTUREN
.
87
4.2.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
.
87
4.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
87
4.2.2.4
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
ARABIDOPSIS
DNA
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
88
4.2.2.5
DNA-REINIGUNG
UND
FAELLUNG
.
88
4.2.2.6
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
.
88
4.2.2.7 DNA-SEQUENZANALYSE
.
88
4.2.2.8
SOUTHERN
BLOT
.
89
4.2.2.9
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
(RANDOM
HEXAMER
PRIMING)
.
89
4.2.2.10
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
BLOTS
.
89
4.2.2.11
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
89
4.2.2.12
ANNEALING
UND
5
'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
90
4.2.2.13
HERSTELLEN
KOMPETENTER
BAKTERIEN-ZELLEN
.
90
4.2.2.14
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
90
4.2.2.15
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
91
4.2.2.16
SUBSTRATAUFNAHMETESTS
.
91
4.2.2.17
TRANSFORMATION
VON
PFLANZEN
.
92
4.2.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
92
4.2.3.1
EXPRESSION
UND
ISOLIERUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
92
4.2.3.2
ISOLIERUNG
VON
HEFEGESAMTMEMBRANEN
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
93
4.2.3.3
ISOLIERUNG
VON
HEFEPLASMAMEMBRANEN
IM
GROSSEN MASSSTAB
.
93
4.2.3.4
ISOLIERUNG
VON
PFLANZLICHEN
MEMBRANPROTEINEN
.
94
4.2.3.5
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
94
4.2.3.6
SDS-PAGE
.
94
4.2.3.7
WESTERN
BLOT
.
94
4.2.4
MIKROSKOPISCHE
TECHNIKEN
.
95
4.2.4.1
REINIGUNG
VON
ANTISEREN
.
95
4.2.4.2
DOT
BLOT
.
95
4.2.4.3
EINBETTUNG
VON
HEFEN
UND
PFLANZEN
IN
METHACRYLAT
.
95
4.2.4.4
HERSTELLUNG
VON
DUENNSCHNITTEN
.
96
4.2.4.5
BEHANDLUNG
DER
SCHNITTE
MIT
ANTIKOERPERN
.
96
4.2.4.6
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
97
4.2.4.6.1
HERSTELLUNG
RNASE-FREIER
LOESUNGEN
.
97
4.2.4.6.2
VORBEHANDLUNG
DER
SCHNITTE
FUER
DIE
HYBRIDISIERUNG
.
97
4.2.4.6.3
LINEARISIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
TEMPLATE-DNA
FUER
DIE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
97
4.2.4.6.4
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
98
4.2.4.6.5
PARTIELLE
HYDROLYSE
DES
TRANSKRIPTS
.
98
4.2.4.6.6
HYBRIDISIERUNG
.
98
4.2.4.6.7
BEHANDLUNG
DER
SCHNITTE
NACH
DER
HYBRIDISIERUNG
.
99
III
_
I
NHALT
4.2.4.6.8
DETEKTION
.
99
4.2.5
METHODEN
ZUR
PHAENOTYPISCHEN
ANALYSE
VON
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
99
4.2.5.1
IN
VITRO
POLLENKEIMUNG
.
99
4.2.5.2
INOKULATION
VON
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
MIT
HETERODERA
SCHACHTII
.
99
4.2.5.2.1
VORBEREITUNG
DER
LARVEN
.
99
4.2.5.2.2
INFEKTION
VON
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.100
4.2.5.3
GUS-FAERBUNG
TRANSGENER
PROMOTOR-GUS-PFLANZEN
.100
4.2.5.4
UNTERSUCHUNG
TRANSGENER
PROMOTOR-GFP-PFLANZEN
.100
5
Z
USAMMENFASSUNG
.
101
(L
ITERATUR
.102
7
A
NHANG
.110
ANHANG
1:
MIPS-NUMMERN
DER
UNTERSUCHTEN
GENE
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
111
ANHANG
2:
PLASMIDKARTE
VON
PACH61
S
.112
ANHANG
3:
PLASMIDKARTE
VON
PACHL
13S
.
113
ANHANG
4:
PLASMIDKARTE
VON
PAS91
.114
ANHANG
5:
PLASMIDKARTE
VON
PP404-GFP
.
115
ANHANG
6:
PLASMIDKARTE
VON
PP404-GUS
.
116
IV |
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