Enzymatische und immuncytochemische Untersuchungen zur Glyconeogenese in astroglialen Zellen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
IX
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
ASTROCYTEN
.
1
1.2.
ASTROCYTEN
ALS
REGULATOREN
DER
EXTRAZELLULAEREN
FLUESSIGKEIT
.
1
1.3.
ASTROCYTEN
UND
GLUCONEOGENESE
.
2
1.4.
ASTROGLIALE
PRIMAERKULTUREN
ALS
MODELL
FUER
STOFFWECHSELUNTERSUCHUNGEN
VON
ASTROCYTEN
.
3
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
.
4
2.
ERGEBNISSE.
.
5
2.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GLYCONEOGENESE
.
6
2.1.1.
SORBITOLBEHANDELTE
ASTROGLIA-REICHE
PRIMAERKULTUREN
ALS
MODELLSYSTEM.
.
6
2.1.2.
BETEILIGUNG
GLUCONEOGENETISCHER
SUBSTRATE
AN
DER
NEUSYNTHESE
VON
GLYCOGEN
IN
ASTROGLIALEN,
SORBITOL
SELEKTIONIERTEN
PRIMAERKULTUREN
.
8
2.1.3.
EINBAU
RADIOAKTIVEN
LACTATS
IN
ASTROGLIALES
GLYCOGEN
VON
NICHT
SORBITOLBEHANDELTEN
ASTROGLIALEN
PRIMAERKULTUREN
.
13
2.1.4.
DOPPELMARKIERUNGSEXPERIMENTE
MIT
D
-
[
,4
ULGLUCOSE
UND
D-[
3
H]GIUCOSE
.
15
2.1.5.
KONZENTRATION
VON
ZELLINHALTSSTOFFEN
IN
ASTROGLIALEN
PRIMAERKULTUREN
.
17
2.1.5.!.
GLYCOLYTISCHE
METABOLITE
.
17
2.1.5.2.
DIE
KONZENTRATION
VON
FRUCTOSE-2,6-BISPHOSPHAT
.
18
2.1.5.3.
ATP-GEHALT
ASTROGLIAIER
KULTUREN
.
20
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.2.
SPEZIFISCHE
AKTIVITAETEN
DER
GLUCONEOGENETISCHEN
ENZYME
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
NEURALEN
ZELLEN
.
21
2.2.1.
DIE
ENZYMATISCHEN
TESTS
.
21
2.2.1.1.
DER
ENZYMATISCHE
TEST
FUER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
21
2.2.1.2.
DER
ENZYMATISCHE
TEST
FUER
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
25
2.2.2.
SPEZIFISCHE
AKTIVITAETEN
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
TLBERTAENDEN
VON
ZELLHOMOGENATEN.
.
27
2.2.3.
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
IN
ASTROGLIALEN
PRIMAERKULTUREN
.
30
2.2
4.
VERSUCHE
ZUR
REGULATION
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
ASTROGLIALEN
PRIMAERKULTUREN
.
31
2.2.4.1.
VERSUCHE
ZUR
REGULATION
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
AKTIVITAETEN
DURCH
VERAENDERTES
NAEHRSTOFFANGEBOT
.
31
2.2.4.2.
VERUCHE
ZUR
HORMONELLEN
REGULATION
VON
PHOSPHOENOL
PYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
ASTROGLIALEN
PRIMAERKULTUREN
.
33
2.2.4.3.
EINFLUSS
VON
PH-WERT
UND
OSMOLARITAET
DES
MEDIUMS
AUF
DIE
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAETEN
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
35
2.3.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
VON
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
UND
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
IM
RATTENHIM
.
36
2.3.1.
REINIGUNG
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
36
2.3.I.I.
REINIGUNG
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
AUS
RINDERLEBER.
.
36
2.3.I.2.
REINIGUNG
VON
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
AUS
KANINCHENLEBER
.
37
2.3.2.
IMMUNISIERUNG
VON
BALB/C-MAEUSEN
GEGEN
PHOSPHOENOLPYRUVAT
CARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
42
2.3.3.
FUSIONSERGEBNISSE
.
43
2
3.4.
PRODUKTION
VON
ASCITES
.
46
2.3.5.
CHARAKTERISIERUNG
DER
VON
DEN
HYBRIDOMEN
PRODUZIERTEN
ANTIKOERPERN
.
48
III
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZELLULAREN
LOKALISATION
VON
FRUCTOSE-1,6
BISPHOSPHATASE
UND
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
50
2.3.6.1.
IMMUNCYTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
VON
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
ASTROGLIALEN
KULTUREN
.
50
2.3.6.2.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
VON
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
53
2.3.6.3.
IMMUNCYTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
56
2.3.6.4.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
59
3.
DISKUSSION
.
63
3.1.
EINBAU
GLUCONEOGENETISCHER
VORLAEUFERVERBINDUNGEN
IN
ASTROGLIALES
GLYCOGEN
.
63
3.1.1.
SORBITOLBEHANDELTE
KULTUREN
ALS
MODELLSYSTEM
.
63
3.1.2.
EINBAU
RADIOAKTIVER
GLUCONEOGENETISCHER
VERBINDUNGEN
IN
ASTROGLIALES
GLYCOGEN
.
65
3.1.2.1.
METHODIK
.
65
3.1.2.2.
VERSUCHSERGEBNISSE
.
66
3.1.3.
EXPERIMENTE
MIT
DOPPELT
MARKIERTER
GLUCOSE
.
68
3.1.3.1.
METHODIK
.
68
3.1.3.2.
VERSUCHSERGEBNISSE
.
69
3.1.4.
EINBAU
VON
RADIOAKTIVEM
LACTAT
IN
DAS
GLYCOGEN
ASTROGLIA-REICHER
PRIMAERKULTUREN
.
75
3.1.5.
KONZENTRATION
VON
FRUCTOSE-2,6-BISPHOSPHAT
IN
ASTROGLIA-REICHEN
PRIMAERKULTUREN
DER
MAUS
.
.76
3.2. DIE
GLUCONEOGENETISCHEN
ENZYME
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXY
KINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
ASTROGLIAZELLEN
.
77
3.2.1.
METHODIK
DER
AKTIVITAETSMESSUNGEN.
.
77
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.2.2.
AKTIVITAETEN
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
77
3.2.3.
MITOCHONDRIALE
LOKALISATION
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
78
3.2.4.
REGULATION
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-1,6
BISPHOSPHATASE
.
78
3.3.
LOKALISATION
DER
GLUCONEOGENETISCHEN
ENZYME
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IN
RATTENHIRNSCHNITTEN
.
81
3.3.1.
REINIGUNG
DER
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
81
3.3.2.
HERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
82
3.3.2.1.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE.
.
82
3.3.2.2.
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
82
3.3.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
.
83
3.3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
DER
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
.
83
3.4.
MOEGLICHE
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER
GLUCONEOGENETISCHEN
ENZYME
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
UND
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
IM
GEHIRN
.
84
3.5.
AUSBLICK
.
86
4.
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
89
4.1.
GERAETE,
MATERIALIEN,
REAGENZIEN
.
89
4.1.1.
GERAETE
.
89
4.1.2.
MATERIALIEN
.
90
4.1.3.
REAGENZIEN
.
91
V
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.
METHODEN
.
94
4.2.1.
ZELLKULTUR.
.
94
4.2.1.2.
HAEUFIG
BENUTZTE
LOESUNGEN
.
94
4.2.1.2.
ALLGEMEINE
ARBEITSSCHRITTE
.
95
4.2.2.
ASTROGLIALE
PRIMAERKULTUREN
.
96
4.2.2.1.
ANLEGEN
UND
UNTERHALTEN
DER
KULTUREN
.
96
4.2.2.2.
INKUBATIONEN
IN
HYPOOSMOLAREN
UND
HYPEROSMOLAREN
MEDIEN
.
97
4.2.2.3.
INKUBATIONEN
ASTROGLIALER
PRIMAERKULTUREN
BEI
VERSCHIEDENEN
PH-WERTEN
.
98
4.2.3.
NEURONEN-REICHE
PRIMAERKULTUREN
.
98
4.2.3.1.
LOESUNGEN
.
98
4.2.3.2.
VORBEREITUNG
.
99
4.2.3.3.
PRAEPARATION
.
99
4.2.3.4.
KULTIVIERUNG
.
99
4.2.4
HEPATOCYTENKULTUREN
.
100
4.2.S.
INKUBATIONEN
MIT
HORMON
ODER
N
6
,O
2
-DIBUTYRYL-CYCLISCHES
ADENOSIN-3':5
'
-MONOPHOSPHAT
ENTHALTENDEN
MEDIEN
.
100
4.2.5.1.
LOESUNGEN
.
100
4.2.5.2.
INKUBATIONEN
.
100
4.2.6.
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
101
4.2.6.1.
LOESUNGEN
.
101
4.2.6.2.
IMMUNISIERUNG.
.
101
4.2.6.3.
KULTIVIERUNG
DER
NSO-ZELLEN
.
102
4.2.6.4.
PRAEPARATION
DER
PERITONEALMAKROPHAGEN
.
103
4.2.6.5.
FUSION
.
104
4.2.6.6.
VERDUENNUNGSKLONIERUNG
.
105
4.2.6.7.
MASSENZELLKULTUR.
.
106
4.2.6.8.
PRODUKTION
VON
ASCITES
.
106
4.2.6.9.
DISSOZIATION
DES
SOLIDEN
TUMORS
.
106
4.2.7.
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
107
4.2.7.1.
LOESUNGEN
.
107
4.2.7.2.
DURCHFUEHRUNG
.
107
4.2.7.3.
TITERBESTIMMUNG
.
108
4.2.8.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.
.
108
INHALTSVERZEICHNIS
VI
4.2.8.I.
LOESUNGEN
.
108
4.2.8.2.
HERSTELLUNG
DER
GELE
.
108
4.2.8.3.
PROBENVORBEREITUNG
.
.
.
109
4.2.8.4.
DURCHFUEHRUNG
.
109
4.2.9.
IMMUNO-"BLOT"
.
109
4.2.9.I.
LOESUNGEN
.
109
4.2.9.2-
DURCHFUEHRUNG
DES
"BLOTS"
.
110
4.2.9.3.
IMMUNFAERBUNG
.
110
4.2.10.
REINIGUNG
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE
AUS
RINDERLEBER
.
110
4.2.10.1.
LOESUNGEN
.
110
4.210.2.
RETROGRADE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
111
4.2.10.3.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
111
4.2.11.
REINIGUNG
DER
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE
AUS
KANINCHENLEBER
.
112
4.2.111.
LOESUNGEN
.
112
4.2.11.2.
AUFSCHLUSS
.
112
4
2.11.3.
UMPUFFERUNG
DURCH
GELFILTRATION
AN
SEPHADEX
G-25
.
112
4.2.11.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
BLUE
SEPHAROSE
.
113
4.2.12.
ANALYTISCHE
GELFILTRATION
AN
DER
FPLC-SAEULE
SUPERDEX
200
.
114
4.2.13.
GEWINNUNG
VON
ZELLHOMOGENATUEBERSTAENDEN
UND
ZELLEXTRAKTEN
.
114
4.2.13.1.
ZELLAUFSCHLUSS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAETEN
PRO
PLATTE
.
114
4.2.13.2.
ZELLAUFSCHLUSS
ZUR
GEWINNUNG
EINES
100000
G-TLBERSTANDES
.
US
4.2.13.3.
GEWINNUNG
VON
CYTOSOLISCHEN
UND
MITOCHONDRIALEN
HOMOGENATUEBERSTAENDEN
ASTROGLIALER
ZELLEN
.
115
4.2.13.4.
GEWINNUNG
VON
CYTOSOLISCHEN
UND
MITOCHONDRIALEN
HOMOGENATUEBERSTAENDEN
AUS
RINDERLEBER
.
116
4.2.13.5.
HERSTELLUNG
VON
HIRN
UND
LEBERHOMOGENATUEBERSTAENDEN.
.
117
4.2.13.6.
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
117
4.2.14.
ENZYMTESTS
.
118
4.2.14.1.
BESTIMMUNG
DER
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYKINASE-AKTIVITAET
.
118
4.2.14.2.
BESTIMMUNG
DER
FRUCTOSE-L,6-BISPHOPHATASE-AKTIVITAET
.
120
4.2.14.3.
BESTIMMUNG
DER
CITRATSYNTHASE-AKTIVITAET
.
122
4.2.14.4.
BESTIMMUNG
DER
LACTATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET
.
123
4.2.15.
GLYCOGENBESTIMMUNG
.
123
4.2.16.
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
GLUCONEOGENETISCHER
VERBINDUNGEN
IN
ASTROGLIALES
GLYCOGEN
.
124
VII
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.16.1.
LOESUNG
.
124
4.2.16.2.
INKUBATION
MIT
GLUCONEOGENETISCHER
VERBINDUNG
.
125
4.2.16.3.
ISOLIERUNG
DES
GLYCOGENS
.
125
4.2.16.4.
LOKALISATION
DER
RADIOAKTIVIEN
MARKIERUNG
.
125
4.2.16.5.
VERSUCHE
ZUR
HEMMUNG
DER
GLYCONEOGENESE
DURCH
INKUBATION
MIT
3-MERCAPTOPICOLINSAEURE
.
126
4.2.16.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
LACTATEINBAU
IN
ASTROGLIALES
GLYCOGEN
BEI
KONSTANTER
GLYCOGENMENGE
.
127
4.2.17.
STUDIEN
ZUM
GLYCOGENAUFBAU
MIT
EINER
MISCHUNG
AUS
I6
3
HLGLUCOSE
UND
[U
14
CJGLUCOSE
IM
INKUBATIONSPUFFER
.
127
4.2.17.1.
REAGENZIEN
.
127
4.2.17.2.
INKUBATIONEN
.
128
4.2.17.3.
AUFARBEITUNG
UND
ANALYSE
DES
GLYCOGENS
UND
DES
INKUBATIONSPUFFERS
.
128
4.2.17.4.
BESTIMMUNG
DER
3
H/
14
C-VERHAELTNISSE
.
128
4.2.18.
METABOLITBESTIMMUNGEN
IN
ZELLYSATEN
.
128
4.2.18.1.
HERSTELLUNG
DER
ZELLYSATE
.
128
4.2.18.2.
BESTIMMUNG
VON
FRUCTOSE-L,6-BISPHOSPHAT
UND
DIHYDROXYACETONPHOSPHAT
.
129
4.2.18.3.
BESTIMMUNG
VON
PYRUVAT
UND
PHOSPHOENOLPYRUVAT
.
130
4.2.18.4.
BESTIMMUNG
VON
GLUCOSE-6-PHOSPHAT
UND
FRUCTOSE-6-PHOSPHAT
.
132
4.2.18
5.
BESTIMMUNG
DER
LACTAT-KONZENTRATION
.
133
4.2.19.
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
DES
INTRAZELLULAEREN
FRUCTOSE-2,6-BISPHOSPHATS
.
134
4.2.19.1.
LOESUNGEN
.
134
4.2.19.2.
HERSTELLUNG
DER
ZELLYSATE
.
135
4.2.19.3.
DURCHFUEHRUNG
.
135
4.2.20.
ATP-BESTIMMUNG
.
136
4.2.20.1.
HERSTELLUNG
DER
ZELLEXTRAKTE
.
136
4.2.20.2.
HERSTELLUNG
DER
ATP-STANDARDS
.
136
4.2
20.3.
DURCHFUEHRUNG
.
137
4.2.21.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
METHODEN
.
137
4.2.21.1.
HERSTELLUNG
DER
GEFRIERSCHNITTE
.
137
4.2.21.2.
IMMUNFAERBUNG
MIT
FLUORESZIERENDEN
CHROMOPHOREN
.
138
INHALTSVERZEICHNIS
VIII
4.2.21.3.
IMMUNFAERBUNG
MIT
STREPTAVIDIN-GEKOPPELTER
PEROXIDASE
.
.138
4.2.22.
IMMUNCYTOCHEMISCHE
METHODEN
.
139
4.2.23.
PROTEINBESTIMMUNG
.
139
4.2.24.
AUSWERTUNG
DER
DATEN
.
139
S.
LITERTURVERZELCHNLS
.
141
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1S1 |
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