Inhibierung der MMP-9-abhängigen Migration kolorektaler Adenokarzinomzellen durch die MMP-9-Hämopexindomäne (MMP-9-PEX):
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2010
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1
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
KOLOREKTALE
KARZINOM
(CRC)
1
1.1.1
EPIDEMIOLOGIE
1
1.1.2
AETIOLOGIE
1
1.1.3
PATHOGENESE
(ADENOM-KARZINOM-SEQUENZ)
2
1.1.4
PATHOLOGISCHE
EINTEILUNG
UND
KLASSIFIKATIONEN
3
1.1.5
KLINIK
UND
DIAGNOSE
5
1.1.6
LOKALISATION
UND
METASTASIERUNGSWEGE
5
1.1.7
THERAPEUTISCHE
OPTIONEN
6
1.1.8
PROGNOSE
7
1.2
INVASION
UND
TUMORMETASTASIERUNG
7
1.2.1
THREE
STEP
THEORY
OF
INVASION
7
1.2.2
FERNMETASTASIERUNG
8
1.3
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
9
1.3.1
DOMAENENSTRUKTUR
DER
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
10
1.4
GELATINASEN
(MMP-2
UND
MMP-9)
12
1.4.1
MMP-2
(GELATINASE
A)
13
1.4.2
MMP-9
(GELATINASE
B)
13
1.5
EINFLUSS
DER
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
AUF
DIE
TUMORINVASION
UND
METASTASIERUNG
17
1.6
INHIBITOREN
DER
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
(MMPIS)
18
1.6.1
TIMPS
UND
WEITERE
NATUERLICHE
INHIBITOREN
18
1.6.2
SYNTHETISCHE
INHIBITOREN
20
1.6.3
INHIBITION
DER
MMP-9-AKTIVITAET
DURCH
DIE
MMP-9-PEX
21
2
ZIELSETZUNG
22
3
MATERIAL
UND
METHODEN
23
3.1
ZELLKULTUR
23
3.1.1
GERAETE
23
3.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
23
3.1.3
CHEMIKALIEN,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
24
3.1.4
ZELLLINIEN
UND
ZELLKULTURMEDIEN
24
3.1.5
KULTIVIERUNG
EUKARYOTER
ZELLEN
24
3.1.6
GEWINNUNG
VON
FIBROBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIEN
26
3.1.7
GEWINNUNG
VON
KONDITIONIERTEN
AUFNAHMEMEDIEN
DURCH
CO-KULTIVIERUNG
VON
KOLONKARZINOMZELLEN
UND
CCD18-FIBROBLASTEN
27
3.2
PROTEINKONZENTRATIONS-BESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
28
3.3
GELATINE-ZYMOGRAPHIE
29
3.3.1
MATERIALIEN
UND
REAGENZIEN
29
3.3.2
HERSTELLUNG
DER
GELE
30
3.3.3
AUFBEREITUNG
DER
PROBEN
30
3.3.4
PROTEINAUFTRENNUNG,
GELATINESPALTUNG
UND
FAERBUNG
DES
GELS
31
3.4
MIGRATIONSASSAY
(BOYDENKAMMER-VERSUCH)
31
3.4.1
AUFBAU
DER
BOYDENKAMMER
31
3.4.2
GELATINEBESCHICHTUNG
DER
ZELLULOSE-FILTER
32
3.4.3
HERSTELLUNG
DER
ZELLSUSPENSION
(NEUBAUER-ZAEHLKAMMER)
32
3.4.4
DURCHFUEHRUNG
DER
MIGRATIONVERSUCHE
33
3.4.5 ANFAERBUNG
DER
FILTER
33
3.4.6
LICHTMIKROSKOPISCHE
AUSWERTUNG
DER
MIGRATION
34
3.5
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
DER
MMP-9-HEMOPEXIN-DOMAENE
34
3.6
ENZYME-LINKED-IMMUNOSORBENT-ASSAY
(ELISA)
34
3.6.1
AUFBAU
UND
INTERPRETATION
35
3.6.2 MATERIALIEN,
GERAETE
UND
REAGENZIEN
35
3.6.3
VORBEREITUNG
DER
PLATTEN
35
3.6.4
DURCHFUEHRUNG
DES
ELISA
36
3.7
STATISTISCHE
METHODEN
36
4
ERGEBNISSE
37
4.1
ZYMOGRAPHISCHER
NACHWEIS
VON
MMP-9
IN
FIBROBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIEN
37
4.2
OPTIMIERUNG
DES
MIGRATIONSASSAYS
FUER
KOLOREKTALE
KARZINOMZELLEN
38
4.2.1
ERGEBNISSE
FUER
DIE
ZELLLINIE
SW-620
39
4.2.2
ERGEBNISSE
FUER
DIE
ZELLLINIE
LS-1
74
46
4.2.3
ERGEBNISSE
FUER
DIE
ZELLLINIE
CACO-2
47
4.2.4
ERGEBNISSE
FUER
DIE
ZELLLINIE
HT-27
50
4.2.5
ZUSAMMENFASSUNG
DER
OPTIMIERUNGSERGEBNISSE
54
4.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
MMP-9-PEX
MITTELS
ELISA
55
4.4
HEMMUNG
DER
MIGRATION
DURCH
DIE
MMP-9-HAEMOPEXIN-DOMAENE
55
4.4.1
AUSSCHLUSS
EINES
UNSPEZIFISCHEN
PROTEINEFFEKTES
56
4.4.2
HEMMUNG
DER
MIGRATION
DER
ZELLLINIE
SW-620
DURCH
DIE
MMP-9-PEX
57
4.4.3
KEINE
HEMMUNG
DER
MIGRATION
DER
ZELLLINIE
LS-1
74
58
5
DISKUSSION
59
5.1
DISKUSSION
DER
ERGEBNISSE
AUS
DEN
OPTIMIERUNGSVERSUCHEN
60
5.2
DISKUSSION
DER
ERGEBNISSE
AUS
DEN
HEMMVERSUCHEN
65
6
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSSICHTEN
71
7
LITERATURVERZEICHNIS
73
8
DANKSAGUNG
87
9
ERKLAERUNG
ZUR
DATENAUFBEWAHRUNG
88
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