Expression und Regulation der Deiodinase Typ 2 im Rahmen des Morbus Basedow und der endokrinen Orbitopathie:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
AETIOLOGIE
UND
PATHOGENESE
DES
MORBUS
BASEDOW
1
1.1.1
AETIOLOGIE
DES
MORBUS
BASEDOW
1
1.1.2
PATHOGENESE
DES
MORBUS
BASEDOW
3
1.2
DIE
ENDOKRINE
ORBITOPATHIE
4
1.2.1
KLINISCHE
ASPEKTE
DER
ENDOKRINEN
ORBITOPATHIE
5
1.2.2
PATHOGENESE
DER
ENDOKRINEN
ORBITOPATHIE
6
1.2.2.1
HISTOLOGIE
6
1.2.2.2
ORBITAFIBROBLASTEN
7
1.2.2.3
ZYTOKINE,
ADHAESIONSMOLEKUELE
UND
ANDERE
IMMUNMODULATORISCHE
PROTEINE
7
1.2.2.4
T-LYMPHOZYTEN
8
1.2.2.5
ORBITALE
ANTIGENE
9
1.2.2.6
ZUSAMMENFASSENDES
KONZEPT
ZUR
PATHOGENESE
DER
ENDOKRINEN
ORBITOPATHIE
11
13
SCHILDDRUESENHONNONSTOFFWECHSEL
12
1.3.1
HISTORISCHES
12
1.3.2
SCHILDDRUESENHONNONE
12
1.3.3
DEIODINASEN
14
1.3.3.1
TYP
1-DEIODINASE
17
1.3.3.2
TYP
2-DEIODINASE
18
1.3.3.3
TYP
3-DEIODINASE
20
1.4
ZIELSETZUNG
22
2
MATERIALIEN
UND
METHODEN
23
2.1
MATERIALIEN
23
2.1.1
GERAETE
23
2.1.2
CHEMIKALIEN
25
2.1.3
SPEZIELLE
REAGENZIEN
UND
MATERIALIEN
25
2.1.4
PUFFER,
STANDARDLOESUNGEN,
MEDIEN
27
2.2
METHODEN
30
2.2.1
ZELLKULTUR
30
2.2.1.1
ISOLIERUNG
HUMANER
FIBROBLASTEN
(PRAEADIPOZYTEN)
30
2.2.1.2
KULTIVIERUNG
30
2.2.1.3
ZELLPASSAGIENMG
31
2.2.1.4
LANGZEITLAGERUNG
DER
ZELLINIEN
DURCH
KRYOKONSERVIERUNG
31
2.2.1.5
STIMULATION
KULTIVIERTER
FIBROBLASTEN
32
2.2.2
RNA-PRAEPARATION
32
2.2.2.1
ALLGEMEINES
ZUM
ARBEITEN
MIT
RNA
33
2.2.2.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
ZELLKULTUR
33
2.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
GEWEBEN
34
2.2.2.4
QUALITAETSKONTROLLE
UND
QUANTIFIZIERUNG
34
2.2.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
34
2.2.4
UV-SPEKTROMETRIE
35
2.2.5
REVERSE
TRANSKRIPTION
VON
RNA
IN
CDNA
35
2.2.6
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
36
2.2.6.1
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
37
2.2.OE.2
VERWENDETE
PRIMER
38
2.2.7
KLONIERUNG
VON
PCR-AMPLIFIZIERTEN
CDNA-FRAGMENTEN
39
2.2.7.1
FAELLUNG
MIT
ETHANOL
40
2.2.7.2
RESTRIKTIONSENZYMHYDROLYSE
40
2.2.7.3
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
41
2.2.7.4
DEPHOSPHORYLIERUNG
41
2.2.7.5
PHENOLEXTRAKTION
VON
DNA
41
2.2.7.OE
LIGATION
42
2.2.7.7
TRANSFORMATION
42
2.2.7.8
ISOLIERUNG
DES
PLASMIDS
43
2.2.8
SEQUENZIERUNG
44
2.2.9
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
45
2.2.9.1
VAKUUM
BLOT
45
2.2.9.2
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN-DDUTP
46
2.2.9.3
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDSONDE
46
2.2.9.4
PRAEHYBRIDISIERUNG
UND
HYBRIDISIERUNG
47
2.2.9.5
CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS
DER
HYBRIDISIERTEN
SONDE
47
2.2.10
NORTHERN
BLOT-ANALYSE
48
2.2.10.1
RNA-ELEKTROPHORESE
48
2.2.10.2
UEBERTRAGUNG
DER
NUKLEOTIDE
AUF
EINE
MEMBRAN
(BLOT)
48
2.2.10.3
HERSTELLUNG
EINER
32
P-MARIDERTEN-CDNA-SONDE
50
2.2.10.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
CDNA-SONDE
51
2.2.10.5
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
51
2.2.10.6
STRIPPEN
UND
REHYBRIDISIERUNG
DER
CDNA-SONDE
52
2.2.11
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
DEIODINASE
TYP 2
IN
KULTIVIERTEN
UND
STIMULIERTEN
ORBITAFIBROBLASTEN
52
2.2.11.1
REINIGUNG
DES
SUBSTRATES
[125IOD]-THYROXIN
53
2.2.11.2
DURCHFUEHRUNG
DER
DEIODINASE
TYP
2-AKTIVITAETSMESSUNG
54
2.2.11.3
BERECHNUNG
DER
SPEZIFISCHEN
DEIODINASE
TYP
2-AKTIVITAET
55
3
ERGEBNISSE
57
3.1
NACHWEIS
VON
DEIODINASE
TYP
2
IN
ORBITAFIBROBLASTEN
57
3.1.1
NACHWEIS
VON
DEIODINASE
TYP
2
MRNA
IN
ORBITALEN
FIBROBLASTEN
MITTELS
POLYMERASEKETTENREAKTION
57
3.1.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFITAET
DER
AMPLIFIZIERTEN
DEIODINASE
TYP 2
AMPLIFIKATIONSPRODUKTE
58
3.1.3
NACHWEIS
DER
DEIODINASE
TYP
2
RNA
IN
ORBITAFIBROBLASTEN
MITTELS
NORTHEM-BLOT
ANALYSE
61
3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REGULATION
DER
DEIODINASE
TYP
2
EXPRESSION
MITTELS
RT
PCR
IN
STIMULIERTEN
ORBITAFIBROBLASTEN
63
33
AKTIVITAETSMESSUNG
DER
DEIODINASE
TYP
2
IN
STIMULIERTEN
ORBITAFIBROBLASTEN
69
3.4
NACHWEIS
DER
DEIODINASE
TYP
2-RNA
IM
SCHILDDRUESENGEWEBE
72
3.4.1
NACHWEIS
VON
DEIODINASE
TYP
2-RNA
IM
SCHILDDRUESENGEWEBE
MITTELS
POLYMERASEKETTENREAKTION
72
3.4.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFITAET
DER
AMPLIFIZIERTEN
DEIODINASE
TYP2
AMPLIFIKATIONSPRODUKTE
IN
SCHILDDRUESENGEWEBE
73
3.4.3
NACHWEIS
VON
DEIODINASE
TYP
2-MRNA
IN
SCHILDDRUESENGEWEBE
MITTELS
NORTHERN
HYBRIDISIERUNG
75
3.4.3.1
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
IN
.MULTIPLE
TISSUE"
NORTHEM-BLOTS
75
3.4.3.2
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
VON
RNA
AUS
VERSCHIEDENEN
SCHILDDRUESEN-GEWEBEN.
77
3.5
SUBKLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
AUS
SCHILDDRUESENGEWEBE
AMPLIFIZIERTER
DEIODINASE-SPEZIFISCHER
CDNA-FRAGMENTE
79
3.5.1
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
DEIODINASE
TYP
2
UND
DES
ALTERNATIV
GESPLEISSTEN
DEIODINASE
TYP
2-TRANSKRIPTS
81
3.5.2
HYDROPHOBIZITAET
82
3.5.3
SEKUNDAERSTRUKTUR
83
3.6
NACHWEIS
DER
DEIODINASE
TYP
2
IN
EXTRATHYREOIDALEN
GEWEBEN.
85
3.6.1
NACHWEIS
VON
DEIODINASE
TYP
2-MRNA
IN
EXTRATHYREOIDALEN
GEWEBEN
MITTELS
POLYMERASEKETTENREAKTION
85
3.6.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFITAET
DER
AMPLIFIZIERTEN
DEIODINASE
TYP2
AMPLIFIKATIONSPRODUKTE
IN
EXTRATHYREOIDALEN
GEWEBEN
85
4
DISKUSSION
88
4.1
EXPRESSION
DER
DEIODINASE
TYP
2
IM
RAHMEN
DES
MORBUS
BASEDOW
UND
DER
ENDOKRINEN
ORBITOPATHIE
88
4.1.1
EXPRESSION
DER
DEIODINASE
TYP
2
IN
DER
SCHILDDRUESE
IM
RAHMEN
DES
MORBUS
BASEDOW
88
4.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
DEIODINASE
TYP
2-EXPTESSION
IN
ORBITALEN
FIBROBLASTEN
IM
RAHMEN
DER
ENDOKRINEN
ORBITOPATHIE
89
4.2
STIMULATION
UND
REGULATION
DER
TYP
2
DEIODINASE
IN
KULTIVIERTEN
ORBITALEN
FIBROBLASTEN
/
PRAEADIPOZYTEN
92
4.2.1
ZYTOKINE
92
4.2.2
SCHILDDRUESENHORMONE
95
4.2.3
GLUKOKORTIKOIDE
97
4.2.4
ADRENALIN
98
4.3
AKTIVITAETSMESSUNG
DER
DEIODINASE
TYP
2
IN
STIMULIERTEN
ORBITAFIBROBLASTEN
101
4.4
DEIODINASE
TYP
2
EXPRESSION
IN
WEITEREN
EXTRATHYREOIDALEN
GEWEBEN
104
4.5
VERGLEICH
DER
DEIODINASE
TYP
2
MIT
EINER
ALTERNATIV
GESPLEISSTEN
VARIANTE
106
4.5.1
HYDROPHOBIZITAETSANALYSE
108
5
ZUSAMMENFASSUNG
109
6
LITERATURVERZEICHNIS
113
7
ABKUERZUNGEN
145
8
DANKSAGUNG
149
9
LEBENSLAUF
151 |
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