Herstellung und Charakterisierung einer Vakzine unter Verwendung dendritischer Zellen und LOXL4-messenger-RNA zur Immuntherapie von Kopf-Hals-Karzinomen:
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Autor: Schmidt, André
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1 1 EINLEITUNG I 1
1.1 Einführung in das Thema 1
1.2 Dendritische Zellen und Immuntherapie 3
1.3 Tumorantigene in Form von mRNA 4
1.4 Die Rolle der Lysyl-Oxidasen und der LOXL4-Isoform 5
~2 ZIELSETZUNGEN 6~
1 MATERIAL UND METHODEN 6~~
3.1 Zellkulturen und Kultivierungsbedingungen 6
3.2. Immunzytochemischer Nachweis von LOXL4 in Zellkulturen 7
3.3. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 7
~JÄ Herkunft des LOXL4-Gens 8~~
3.4.1 DNA-Sequenzierung und Datenbankvergleich 8
3.4.2 Extraktion des Plasmidvektors aus Bakterienklonen 9
3.4.3 Überprüfung der im Vektor integrierten LOXL4-CDNA 10
3.4.4 Aufreinigung der LOXL4-CDNA ÜT~
33 Umklonierung der LOXL4-cDNA TT~
3.5.1 Restriktionsverdau 11
3.5.2 Dephosphorylierung 11
3.5.3 Ligation der LOXL4-cDNA in pSP73/A64/NotI Vektor 12~~
3.5.4 Transformation des Ligationsproduktes in kompetente E.coli 12
3.5.5 Gewinnung von LOXL4-mRNA 14
3.5.6 ln-vitro Transkription 14
3.6 Herstellung von unreifen dendritischen Zellen (DC) 14
3.6.1 Monozyten-Leukapherese und Stimulation 14
3.6.2 Phänotypische Charakterisierung der unreifen DC 15
3.6.3 Transfektion der unreifen DC durch Elektroporation 15
3.7 Expressionskontrolle 17
3.7.1 Durchflußzytometrie 11
3.7.2 Western-Blot ÜT~
3.7.3 Immunzytochemischer Nachweis von LOXL4 in DC 18
1 ERGEBNISSE 19
Tl Immunzytochemischer Nachweis des LOXL4 Proteins in Karzinomzellen 19
~42 Nachweis des LOXL4 Proteins mittels konfokaler Laser-Scanning- 20
Mikroskopie
~43 Umklonierung der LOXL4-cDNA ~ 21
4.4 Überprüfung der Identität der LOXL4-cDNA 21
~4l Transfektion der DC mit LOXL4-mRNA 23
4.6 Phänotypische Charakterisierung unreifer und reifer DC 25
1/7 Western-Blot ~~ 26
4.8 Immunzytochemischer Nachweis von LOXL4 27
1 DISKUSSION 28
5.1 LOXL4, ein Mitglied der Lysyl-Oxidase Familie, ist überexprimiert in Kopf- 28
Halskarzinomen
5.2 DC-basierende Vakzine und LOXL4 30
5.3 Verwendung der RNA-Vakzine 32
5.4 Bewertung der zellulären Immuntherapie, Kritik der Methodik und 34
Schlussfolgerung
~6 ZUSAMMENFASSUNG 36~~
7 LITERATURVERZEICHNIS 37~
DANKSAGUNG 45~
LEBENSLAUF 46~
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