Molekulare Charakterisierung autophagozytotischer Prozesse im Reisbranderreger Magnaporthe oryzae:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Duisburg ; Köln
WiKu-Wiss.-Verl. Stein
2013
|
| Schriftenreihe: | Ston's publishing Cologne
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 233 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
| ISBN: | 9783865534262 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG *
1.1 MAGNAPORTHE ORYZAE, DER ERREGER DES REISBRANDES 1
1.2 AUTOPHAGOZYTOSE 3
1.2.1 AUTOPHAGOSOMBIOGENESE 5
1.3 SEKUNDAERMETABOLISMUS IN MAGNAPORTHE ORYZAE 9
1.4 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION 11
1.5 ZIELSETZUNG 12
2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 MATERIAL 13
2.1.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 13
2.1.2 ANTIKOERPER UND ENZYME 17
2.1.3 REAKTIONSKITS 17
2.1.4 LOESUNGEN UND PUFFER 18
2.1.4.1 LOESUNGEN 18
2.1.4.2 PUFFER 23
2.1.5 KULTURMEDIEN 27
2.1.5.1 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON BAKTERIEN 27
2.1.5.2 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON HEFEN 29
2.1.5.3 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON FILAMENTOESEN PILZEN 30
2.1.5.4 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON ZELLEN 32
2.1.6 ORGANISMEN UND ZELLKULTUREN 32
2.1.6.1 VERWENDETE ESCHERICHIA COLI-STAEMME 32
2.1.6.2 VERWENDETER AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-STEMM 32
2.1.6.3 VERWENDETE SACCHAROMYCES CEREWSAE-STAEMME 33
2.1.6.4 VERWENDETER MAGNAPORTHE ORYZAE-STAMM 33
2.1.6.5 VERWENDETE TESTORGANISMEN 34
2.1.6.6 VERWENDETE ZELLLINIE 35
2.1.7 VERWENDETES SAATGUT 35
2.1.8 VERWENDETE PLASMIDE 35
2.1.9 VERWENDETE PRIMER 39
2.1.10 MIKROSKOPIE 41
2.1.11 PHOTOGRAPHIE 42
2.1.12 SOFTWARE 42
2.1.12.1 DATENBANKEN 42
2.1.12.2 PROGRAMME 42
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 43
2.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 43
2.2.1.1 KOLONIE-PCR 44
2.2.1.2 HERSTELLUNG DIG-MARKIERTER DNA-SONDEN 45
2.2.1.3 QUANTITATIVE RT-PCR 45
2.2.2 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN 47
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS ESCHERICHIA COLI 47
2.2.2.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS MAGNAPORTHE ORYZAE 47
2.2.2.3 ISOLIERUNG VON RNA AUS MAGNAPORTHE ORYZAE 47
2.2.2.4 QUANTITATIVE BESTIMMUNGEN VON NUKLEINSAEUREN 48
2.2.3 RESTRIKTION UND GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 48
2.2.3.1 RESTRIKTION VON DNA 48
2.2.3.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 49
2.2.3.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN 49
2.2.4 LIGATION UND KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 49
2.2.4.1 LIGATION 49
2.2.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTEN 49
2.2.5 TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN 50
2.2.5.1 PRAEZIPITATION VON DNA 50
2.2.5.2 SOUTHERN BLOT-ANALYSE 50
2.2.6 CDNA-SYNTHESE 51
2.2.7 SEQUENZIERUNG VON DNA 51
2.2.8 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI 51
2.2.8.1 PRAEPARATION ELEKTROKOMPETENTER ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 51
2.2.8.2 PRAEPARATION CHEMISCH KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 51
2.2.8.3 PRAEPARATION CHEMISCH KOMPETENTER AGROBACTERIUM
FUMEFAC/ ENS-ZELLEN 52
2.2.8.4 TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 52
2.2.8.5 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 53
2.2.8.6 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-
ZELLEN 53
2.2.9 TRANSFORMATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE 53
2.2.9.1 PRAEPARATION CHEMISCH KOMPETENTER SACCHAROMYCES CEREVISIAE-ZELLEN
53
2.2.9.2 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER SACCHAROMYCES CEREVISIAE-
ZELLEN 54
2.2.10 TRANSFORMATION VON MAGNAPORTHE ORYZAE 54
2.2.10.1 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VERMITTELTE TRANSFORMATION VON
MAGNAPORTHE ORYZAE 54
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.11 KLONIERUNGSSTRATEGIEN 55
2.2.11.1 KONSTRUKTION DES ESCHERICHIA COLI EXPRESSIONSVEKTORS 55
2.2.11.2 KONSTRUKTION DER SACCHAROMYCES CEREVISIAE EXPRESSIONSVEKTOREN
55
2.2.11.3 KONSTRUKTION DER SACCHAROMYCES CEREVISIAE
KOMPLEMENTATIONSVEKTOREN OHNE FUSIONSTAG 56
2.2.11.4 KONSTRUKTION DER MAGNAPORTHE ORYZAE EXPRESSIONSVEKTOREN 56
2.2.11.5 KONSTRUKTION DER DELETIONSVEKTOREN 56
2.2.11.6 KONSTRUKTION DER KOMPLEMENTATIONSVEKTOREN 57
2.2.11.7 KONSTRUKTION DER M0GFP-ATG8 EXPRESSIONSVEKTOREN 57
2.2.11.8 KONSTRUKTION DES MOTRS85-GFP EXPRESSIONSVEKTORS 58
2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 63
2.3.1 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI 63
2.3.1.1 ZELLAUFSCHLUSS VON ESCHERICHIA COLI 63
2.3.1.2 ELIMINIERUNG DES ESCHERICHIA COLI CHAPERONS DNAKP 63
2.3.1.3 IN-LINE PULLDOWN-ASSAY 63
2.3.2 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 64
2.3.2.1 ZELLAUFSCHLUSS VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE 64
2.3.3 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN MAGNAPORTHE ORYZAE 65
2.3.3.1 ZELLAUFSCHLUSS VON MAGNAPORTHE ORYZAE 65
2.3.4 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN 65
2.3.5 BESTIMMUNG DER PROTEIN-KONZENTRATION 65
2.3.6 REINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 66
2.3.6.1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 66
2.3.6.1.1 GLUTATHION-S-TRANSFERASE- AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 66
2.3.6.1.2 HEXAHISTIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 66
2.3.6.1.3 STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 67
2.3.6.2 ENTSALZUNG VON PROTEINEN 67
2.3.7 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 67
2.3.8 TRANSFER VON PROTEINEN 68
2.3.8.1 WESTERN BLOT-ANALYSE 68
2.3.9 2D-GELELEKTROPHORESE 69
2.3.9.1 KULTIVIERUNG DER ZUR PROTEOMANALYSE VERWENDETEN STAEMME 69
2.3.9.2 PROTEINGEWINNUNG 69
2.3.9.3 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (1. DIMENSION) 70
2.3.9.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (2. DIMENSION) 70
2.3.9.5 FAERBUNG DER 2D-GELE 71
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.10 IDENTIFIKATION VON PROTEINEN MITTELS TANDEM-
MASSENSPEKTROSKOPIE 71
2.3.10.1 AUSSCHNEIDEN AUFGETRENNTER PROTEINE 71
2.3.10.2 TRYPTISCHE SPALTUNG DER PROTEINE IM GEL 71
2.3.10.3 ENTSALZUNG DER TRYPTISCH VERDAUTEN PEPTIDE 72
2.3.10.4 PROTEINSEQUENZIERUNG MITTELS TANDEM-MASSENSPEKTROSKOPIE 72
2.5 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DES SEKUNDAERMETABOLISMUS IN MAGNAPORTHE
ORYZAE 73
2.5.1 FERMENTATION IN SUBMERSKULTUR 73
2.5.2 FERMENTATION IM 20 I-MASSSTAB 73
2.5.3 HERSTELLUNG VON ROHEXTRAKTEN 74
2.5.4 FERMENTATIONSANALYSEN 74
2.5.4.1 PH-WERT 74
2.5.4.2 MYZELTROCKENGEWICHT 74
2.5.4.3 QUANTITATIVE WIRKSTOFFBESTIMMUNG 74
2.5.5 HPLC-ANALYSE VON ROHEXTRAKTEN 75
2.5.6 HPLC/MS-ANALYSE 75
2.5.6.1 RELATIVE QUANTIFIZIERUNG MITTELS HPLC/MS 76
2.5.7 AUFREINIGUNG 77
2.5.7.1 FESTPHASENEXTRAKTION AN CHROMABOND-KARTUSCHEN 77
2.5.7.2 PRAEPARATIVE HPLC 77
2.5.8 UVA/IS-SPEKTROSKOPIE 77
2.5.9 METHODEN ZUR BIOLOGISCHEN CHARAKTERISIERUNG DER REINSUBSTANZ 78
2.5.9.1 AGARDIFFUSIONSTEST 78
2.5.9.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR SPORENKEIMUNGSHEMMUNG 78
2.5.9.3 ZYTOTOXIZITAETSTEST 78
2.5.9.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR PFLANZENKEIMUNGSHEMMUNG 79
2.5.9.5 PHYTOTOXIZITAETSTEST GEGEN REISBLATTSEGMENTE 79
2.5.10 METHODEN ZUR PHAENOTYPISCHEN CHARAKTERISIERUNG DER
SACCHAROMYCES CEREW S/AE-MUTANTEN 79
2.5.10.1 UEBERLEBENSRATE UNTER STICKSTOFFMANGELBEDINGUNGEN 79
2.5.11 METHODEN ZUR PHAENOTYPISCHEN CHARAKTERISIERUNG DER
MAGNAPORTHE ORYZAE-MUTANTEN 80
2.5.11.1 HERSTELLUNG VON KONIDIENSUSPENSIONEN 80
2.5.11.2 VERGLEICH DER KONIDIENPRODUKTION 80
2.5.11.3 VERGLEICH DES RADIALEN WACHSTUMS AUF VERSCHIEDENEN FESTMEDIEN
80
2.5.11.4 PATHOGENITAETSASSAYS 81
2.5.11.4.1 PATHOGENITAETSASSAY AUF INTAKTEN REISPFLANZEN 81
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.11.4.2 PATHOGENITAETSASSAY AN BLATTSEGMENTEN 81
2.5.11.5 ZYTORRHYSE-TEST 81
2.5.11.6 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 82
2.5.11.7 UNTERSUCHUNGEN ZUR SEKRETION 82
3. ERGEBNISSE 83
3.1 DAS AUTOPHAGOZYTOTISCHE ATG8P-KONJUGATIONSSYSTEM 83
3.1.1 HETEROLOGE EXPRESSION VON MOSTREP-ATG8P IN ESCHERICHIA COLI 86
3.1.1.1 ENTFERNUNG DES E. COLI CHAPERONS DNAKP 88
3.1.1.2 IN-LINE PULLDOWN-ASSAY 89
3.1.2 HETEROLOGE EXPRESSION DER FUSIONSPROTEINE IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 90
3.1.2.1 HETEROLOGE EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS MOGST-ATG3P IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 91
3.1.2.2 HETEROLOGE EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS MOSTREP-ATG7P IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 93
3.1.2.3 HETEROLOGE EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS MOSTREP-ATG8P IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 95
3.1.3 KOMPLEMENTIERUNG DER SACCHAROMYCES CEREVIS/ AE-MUTANTEN
MITTELS MAGNAPORTHE OFYZAE-FUSIONSPROTEINE 97
3.1.3.1 KOMPLEMENTIERUNG DER ASCATG3 MUTANTEN YNR007C 97
3.1.3.2 KOMPLEMENTIERUNG DER ASCATG7 MUTANTEN YHR171W 98
3.1.3.3 KOMPLEMENTIERUNG DER ASCATGSS MUTANTEN YBL078C 98
3.1.4 KOMPLEMENTIERUNG AUTOPHAGOZYTOSE-DEFIZIENTER SACCHAROMYCES
CEREW S/ AE-MUTANTEN MITTELS MAGNAPORTHE ORYZAE-PROTEINE OHNE
FUSIONSTAG 98
3.1.5 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG AUTOPHAGOZYTOSE-DEFIZIENTER
SACCHAROMYCES CEREVISIAE-MUTANTEN 99
3.1.6 HOMOLOGE EXPRESSION DER FUSIONSPROTEINE IN MAGNAPORTHE
ORYZAE 101
3.1.6.1 INAKTIVIERUNGEN AUSGEWAEHLTER KANDIDATENGENE 102
3.1.6.1.1 INAKTIVIERUNG VON MOATG3 102
3.1.6.1.2 INAKTIVIERUNG VON MOATGL 103
3.1.6.2 KOMPLEMENTIERUNG DER MUTANTEN 104
3.1.6.2.1 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG3 MUTANTE MITTELS MOATG3 105
3.1.6.2.2 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG7 MUTANTE MITTELS MOATG7 105
3.1.6.3 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOATG3P ALS FUSIONSPROTEIN IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 106
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.6.3.1 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG3 MUTANTE MITTELS MOGST-ATG3 107
3.1.6.3.2 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOGST-ATG3P IN MAGNAPORTHE ORYZAE 108
3.1.6.3.3 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG3 MUTANTE MITTELS MOATG3-HISP 109
3.1.6.3.4 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOATG3-HISP IN MAGNAPORTHE ORYZAE 110
3.1.6.3.5 NACHWEIS DER EXPRESSION DES MOATG3-HISP FUSIONSPROTEINS
MITTELS WESTERN-BLOT 110
3.1.6.3.6 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG3 MUTANTE MITTELS MOATG3-STREP...
111
3.1.6.3.7 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOATG3-STREPP IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 112
3.1.6.4 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOATG7P ALS FUSIONSPROTEIN IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 114
3.1.6.4.1 KOMPLEMENTIERUNG DER AMOATG7 MUTANTE MITTELS
MOSTREP-ATG7P 114
3.1.6.4.2 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOSTREP-ATG7P IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 115
3.1.6.5 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOATG8P ALS FUSIONSPROTEIN IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 116
3.1.6.5.1 KOMPLEMENTIERUNG DER^MO/A7G8 MUTANTE MITTELS MOSTREP-ATG8..A16
3.1.6.5.2 HOMOLOGE EXPRESSION VON MOSTREP-ATG8P IN
MAGNAPORTHE ORYZAE 117
3.1.6.5.3 NACHWEIS DER EXPRESSION DES MOSTREP-ATG8P FUSIONSPROTEINS
MITTELS WESTERN-BLOT 118
3.1.7 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MAGNAPORTHE ORYZAE-
MUTANTEN 119
3.1.7.1 RADIALES WACHSTUM AUF FESTMEDIEN 119
3.1.7.2 VERGLEICH DER KONIDIENPRODUKTION 121
3.1.7.3 PATHOGENITAETSASSAY AUF INTAKTEN REISPFLANZEN 123
3.1.7.4 DAS WACHSTUM DER MUTANTEN UNTER HYPEROSMOTISCHEM STRESS 124
3.1.8 VERGLEICHENDE PROTEOMANALYSE ZWISCHEN DEM MAGNAPORTHE
ORYZAE WILDTYPSTAMM 70-15 UND DER MUTANTE AMOATG3 127
3.1.8.1 VERGLEICHENDE ANALYSE ZYTOPLASMATISCHER PROTEINE MITTELS 2D-
GELELEKTROPHORESE 127
3.1.8.2 VERGLEICHENDE ANALYSE DES SEKRETOMS MITTELS SDS-PAGE 129
3.1.8.3 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSEN 130
3.1.8.4 DIE PROTEINE DER PYRICULOLBIOSYNTHESE KOMMEN VERMEHRT IN DER
MUTANTE
AMOATG3 VOR 132
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.9 VERGLEICHENDE ANALYSE DES SEKUNDAERSTOFFMETABOLISMUS IN
VERBINDUNG MIT DER INAKTIVIERUNG VON AMOATG3 134
3.1.9.1 FAEHIGKEIT ZUR INDUKTION VON LAESIONEN AN REISBLATTSEGMENTEN 134
3.1.9.1.1 IDENTIFIZIERUNG PHYTOTOXISCHER SEKUNDAERMETABOLITE 136
3.1.9.2 RELATIVE QUANTIFIZIERUNG AUSGEWAEHLTER METABOLITEN 137
3.1.9.3 GENEXPRESSIONSSTUDIEN MITTELS QRT-PCR 143
3.1.10 AUTOPHAGOZYTOSE-MUTANTEN ALS PRODUZENTEN VON
SEKUNDAERMETABOLITEN 144
3.1.10.1 FERMENTATION VON AM0ATG8 145
3.1.10.2 ISOLIERUNG VON PHOMOPYRONOL AUS AM0ATG8 145
3.1.10.3 PHYSIKALISCH-CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PHOMOPYRONOL 146
3.1.10.4 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PHOMOPYRONOL 147
3.1.10.4.1 ANTIMIKROBIELLES WIRKUNGSSPEKTRUM 148
3.1.10.4.2 SPORENKEIMUNGSHEMMUNG 148
3.1.10.4.3 ZYTOTOXIZITAET 148
3.1.10.4.4 PHYTOTOXIZITAET 148
3.2.1 AUSWAHL DER KANDIDATENGENE 150
3.2.1.1 INAKTIVIERUNG VON MOYPTI 152
3.2.1.2 KNOCK-DOWN VON MOYPTI 152
3.2.1.3 INAKTIVIERUNGSMUTAGENESE VON MOTRS85 153
3.2.1.4 KOMPLEMENTIERUNG DER AM0TRS85 MUTANTE 154
3.2.2 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG 155
3.2.2.3 PATHOGENITAETSASSAYS 157
3.2.2.3.1 PATHOGENITAETSASSAY AN BLATTSEGMENTEN 157
3.2.2.3.2 PATHOGENITAETSASSAY AUF INTAKTEN REISPFLANZEN 157
3.2.2.4 UNTERSUCHUNG DER KEIMUNGS- UND APPRESSORIENBILDUNGSRATE 158
3.2.2.6 LOKALISIERUNGSSTUDIEN MITTELS GFP-FUSIONSPROTEINEN 159
3.2.2.6.1 LOKALISIERUNG DES AUTOPHAGOZYTOSE-MARKERPROTEINS
MOGFP-ATG8P...159
3.2.2.6.1 LOKALISIERUNG VON MOTRS85-GFPP 161
3.2.2.7 SEKRETIONSANALYSE 162
4. DISKUSSION 165
4.1 DAS ATG8P-KONJUGATIONSSYSTEM 166
4.1.1 ETABLIERUNG EINES TESTSYSTEMS ZUR SUCHE NACH INHIBITOREN DER
AUTOPHAGOZYTOSE 166
4.1.1.1 ESCHERICHIA COLI ALS HETEROLOGES EXPRESSIONSSYSTEM REKOMBINANTER
AUTOPHAGOZYTOSE-PROTEINE 169
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.2 SACCHAROMYCES CEREVISIAE ALS HETEROLOGES EXPRESSIONSSYSTEM
REKOMBINANTER AUTOPHAGOZYTOSE-PROTEINE 172
. 4.1.1.3 MAGNAPORTHE ORYZAE ALS HOMOLOGES EXPRESSIONSSYSTEM
REKOMBINANTER
AUTOPHAGOZYTOSE-PROTEINE 176
4.1.2 DIE AUTOPHAGOZYTOSE MODULIERT DIE HYPEROSMOTISCHE
STRESSANTWORT 181
4.1.3 PROTEOMANALYSEN ZEIGEN DIE MODULATION DES
SEKUNDAERMETABOLISMUS DURCH DIE AUTOPHAGOZYTOSE AUF 184
4.1.4 AM0ATG8 ALS PRODUZENT VON SEKUNDAERMETABOLITEN 192
4.1.5 AUSBLICK 194
4.2 DIE MEMBRANFUSION IN DER AUTOPHAGOSOMBIOGENESE 195
4.2.1 DIE AUSWAHL DER KANDIDATENGENE 195
4.2.2 MOYPHP IST EIN ESSENTIELLES PROTEIN 195
4.2.3 MOTRS85P IST ESSENTIELL FUER AUTOPHAGOZYTOTISCHE PROZESSE 196
4.2.4 MOTRS85P IST AN DER SEKRETION VON PROTEASEN BETEILIGT 199
4.2.5 AUSBLICK 201
5. ZUSAMMENFASSUNG 202
6. LITERATURVERZEICHNIS 204
7. ANHANG 232
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