Aufbau eines Systems zur Untersuchung peroxisomaler Protein-Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle mittels Biolumineszenz Resonanzenergietransfer:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS III
ABKUERZUNGEN -. VIII
ZUSAMMENFASSUNG X
1. EINLEITUNG 1
1.1. BEDEUTUNG VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN (PPI) 1
1.2. METHODEN ZUR DETEKTION VON PPI 2
1.2.1. FOERSTER-RESONANZENERGIETRANSFER-VERFAHREN ZUR DETEKTION VON PPI 2
1.2.1.1. FOERSTER-RESONANZENERGIETRANSFER 2
1.2.1.2. FLUORESZENZ RESONANZENERGIETRANSFER (FRET) 5
1.2.1.3. BIOLUMINESZENZ RESONANZENERGIETRANSFER (BRET) 5
1.2.1.4. FLUORESZENZLEBENSDAUER-MIKROSKOPIE (FLIM) 6
1.2.2. ANDERE VERFAHREN ZUR DETEKTION VON PPI 7
1.2.2.1. BIMOLEKULARE FLUORESZENZKOMPLEMENTATION (BIFC) 7
1.2.2.2. CO-IMMUNPRAEZIPITATION 7
1.2.2.3. YEAST TWO-HYBRID (Y2H)-SYSTEM 8
1.2.2.4. OBERFLAECHENPLASMONENRESONANZ (SPR)-SPEKTROSKOPIE 8
1.2.2.5. TANDEM AFFINITAETSREINIGUNG (TAP) 8
1.2.2.6. MASSENSPEKTROMETRISCHE HOCHDURCHSATZ
PROTEINKOMPLEX-IDENTIFIKATION (HMS-PCI) 10
1.2.2.7. SYNEXPRESSION (KORRELIERTE MRNA-EXPRESSION) UND GENETISCHE
INTERAKTIONEN 10
1.2.2.8. IN SILICO-VORHERSAGEN DURCH GENOMANALYSEN 10
1.3. ANFORDERUNGEN AN DIE METHODEN ZUR DETEKTION VON PPI 10
1.4. DAS PEROXISOM 13
1.4.1. FUNKTIONEN DES PEROXISOMS 13
1.4.2. BIOGENESE UND VERMEHRUNG DER PEROXISOMEN 14
1.4.3. BIOSYNTHESE PEROXISOMALER MEMBRANEN UND IMPORT VON
MEMBRANPROTEINEN 15
1.4.4. IMPORT PEROXISOMALER MATRIXPROTEINE 15
1.4.5. DIE PEROXINE PEX3 UND PEX19 17
III
HTTP://D-NB.INFO/1058576763
INHALTSVERZEICHNIS
1.4.6. DAS PEROXIN PEX26 17
1.4.7. DER PEROXISOMALE ABC-TRANSPORTER ABCD1 18
* 1.4.8. PEROXISOMALE ERKRANKUNGEN BEIM MENSCHEN 19
1.5. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 21
2. MATERIAL UND METHODEN 22
2.1. MATERIALIEN UND GERAETE 22
2.1.1. CHEMIKALIEN 22
2.1.2. ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN 22
2.1.3. BAKTERIENSTAEMME 22
2.1.4. ANZUCHTMEDIEN FUER PROKARYONTEN 23
2.1.5. EUKARYONTISCHE ZEIL-LINIEN 23
2.1.6. MEDIEN UND ANTIBIOTIKA FUER DIE EUKARYONTISCHE ZELLKULTUR 23
2.1.7. ENZYME ZUR DNA-MODIFIKATION 24
2.1.8. EINGESETZTE MATERIALIEN FILR DIE DNA-SEQUENZIERUNG 24
2.1.9. LAENGEN-UND MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS 24
2.1.10. REAGENZIEN FUER DIE HORIZONTALE GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG
VON NUKLEINSAEUREN 24
2.1.11. PRIMAERE UND SEKUNDAERE ANTIKOERPER SOWIE NACHWEISREAGENZIEN FUER
DIE
IMMUNFLUORESZENZ 24
2.1.12. GERAETE, REAGENZIEN UND MATERIAL ZURTRANSFEKTION 25
2.1.13. VEKTOREN UND PLASMIDE 25
2.1.14. SUBSTRATE FUER LUMINESZENZ- UND BRET-MESSUNGEN 25
2.1.15. GERAET ZUR HIGH THROUGHPUT-DETEKTION 25
2.1.16. GERAET ZUR DETEKTION DES ENERGIETRANSFERS AM SPEKTROPHOTOMETER
(BRET-SCAN) 26
2.1.17. FLUORESZENZMIKROSKOP UND FLUORESZENZFILTER 26
2.2. METHODEN 27
2.2.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 27
2.2.1.1. ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI 27
2.2.1.2. ESCHERICHIA COLI DAUERKULTUREN 27
2.2.1.3. TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN 27
2.2.1.4. ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS E. COLI-ZELLEN 28
2.2.1.4.1. MINIPREP VON PLASMID-DNA 28
IV
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.4.2. MIDI- BZW. MAXIPREP VON PLASMID-DNA 28
2.2.1.5. PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 29
2.2.1.6. HORIZONTALE GELELEKTROPHORESE IM AGAROSEGEL 29
2.2.1.7. AUFREINIGUNG UND GELELUTION
VON DNA 29
2.2.1.8. SCHNEIDEN VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
2.2.1.9. DEPHOSPHORYLIERANG VON NUKLEINSAEURE-ENDEN 30
2.2.1.10. LIGATION 30
2.2.1.11. PCR-AMPLIFIKATION 30
2.2.1.11.1. EXPAND HIGH FIDELITY PCR SYSTEM 30
2.2.1.11.2. PHUSION* HIGH-FIDELITY DNA POLYMERASE 31
2.2.1.12. DNA-SEQUENZANALYSE 31
2.2.1.13. SITE DIRECTED MUTAGENESIS 32
2.2.1.14. GATEWAY* CLONING 33
2.2.1.14.1. ERSTELLUNG VON ENTRY EBNES (BP-REAKTION) 34
2.2.1.14.2. ERSTELLUNG VON EXPRESSION CLONES (LR-REAKTION) 34
2.2.1.15. KLONIERUNG MITTELS IN-FUSION* PCR CLONING SYSTEM 34
2.2.2. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 35
2.2.2.1. ALLGEMEINE ZELLKULTUR 35
2.2.2.2. GENERATIONSWECHSEL DER ZELLEN 35
2.2.2.3. VORBEREITUNG DER ZELLEN FUER DIE NUKLEOFEKTION 35
2.2.2.4. HOCHDURCHSATZ-TRANSFEKTION AM AMAXA* NUCLEOFECTOR* 96-WELL
SHUTTLE* SYSTEM...
: 36
2.2.2.5. TRANSFEKTION AM AMAXA NUCLEOFECTOR* II 37
2.2.3. FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE METHODEN 37
2.2.3.1. HOCHDURCHSATZ-DETEKTION DES IN VIVO-BRET AM LUMISTAR OPTIMA 37
2.2.3.2. DETEKTION DES IN VIVO-BRET AM CARY ECLIPSE SPEKTROPHOTOMETER
(BRET-SCAN) 37
2.2.3.3. BRET-RATIO 38
2.2.3.4. IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG 38
2.2.3.5. FLUORESZENZMIKROSKOPIE 39
ERGEBNISSE 40
3.1. ETABLIERUNG EINER NEUEN METHODE ZUR UNTERSUCHUNG VON
PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN 40
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1. ERSTELLUNG DER DESTINATION VECTORS (DEST-VEKTOREN) FUER DAS
GATEWAY*-SYSTEM 40
3.1.1.1. VERWENDUNG VON RLUC MIT HUMANISIERTEM CODONGEBRAUCH (HRLUC) 40
3.1.1.1.1. ERSTELLUNG VON N-HRLUC-DEST 41
3.1.1.1.2. ERSTELLUNG VON C-HRLUC-DEST 42
3.1.1.2. MUTAGENISIERUNG VON EYFP ZU VENUS 43
3.1.1.2.1. ERSTELLUNG VON N-VENUS-DEST 45
3.1.1.2.2. ERSTELLUNG VON C-VENUS-DEST 46
3.1.2. RAPID CLONING: ERSTELLUNG VON GATEWAY*-KONSTRUKTEN 46
3.1.2.1. ERSTELLUNG ATT-SITE-FLANKIERTER PCR-PRODUKTE 48
3.1.2.2. ERSTELLUNG VON ENTRY CLONES (BP-REAKTION) 51
3.1.2.3. ERSTELLUNG VON EXPRESSION CLONES (LR-REAKTION) 51
3.1.3. TRANSIENTE HOCHDURCHSATZ-TRANSFEKTION IN EUKARYONTE ZELLEN
MITTELS AMAXA*
NUCLEOFECTOR* 96-WELL SHUTTLE* SYSTEM (NUKLEOFEKTION) 51
3.1.3.1. OPTIMIERUNG DER PROGRAMMWAHL 52
3.1.3.2. OPTIMIERUNG DER ZELLZAHL 52
3.1.3.3. OPTIMIERUNG DER DNA-KONZENTRATION 53
3.1.4. HOCHDUFCHSATZ-DETEKTION AM LUMISTAR
OPTIMA (BMG LABTECH) 55
3.1.4.1. OPTIMIERUNG DES INJEKTIONSMODUS (TIME OPTIMIZED MODUS) 56
3.1.4.2. VERKUERZUNG DER MESSZEIT 57
3.1.5. DETEKTION DES ENERGIETRANSFERS AM SPEKTROPHOTOMETER (BRET-SCAN)
58
3.1.6. BESTIMMUNG EINES SCHWELLENWERTES FUER POSITIVE INTERAKTIONEN 59
3.1.7. ORIENTATION MATTERS
- DIE BEDEUTUNG DER STRUKTUR DER FUSIONSPROTEINE FUER DIE INTERAKTION ..
60
3.1.7.1. VIER EXPERIMENTE BEI UNTERSUCHUNG DER HOMODIMERISIERUNG 61
3.1.7.2. ACHT EXPERIMENTE BEI UNTERSUCHUNG DER HETERODIMERISIERUNG 61
3.1.8. MODIFIKATION DER AKZEPTOR/DONOR-RATIO ZUR UNTERSCHEIDUNG
RICHTIG-POSITIVER VON FALSCH
POSITIVEN ERGEBNISSEN 62
3.1.8.1. UNTERSUCHUNG EINER POSITIVEN INTERAKTION: HOMODIMERISIERUNG VON
ADRB2 63
3.1.8.2. UNTERSUCHUNG EINER NEGATIVEN INTERAKTION: HOMODIMERISIERUNG VON
CD2 64
3.2. VALIDIERUNG BEKANNTER INTERAKTIONEN IN VERSCHIEDENEN ZELLULAEREN
KOMPARTIMENTEN 66
3.2.1. ZELLMEMBRAN: ADRB2 66
VI
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2. ZYTOPLASMA UND PEROXISOM: PEX19 UND PEX3 66
3.2.3. PEROXISOM: ABCD1 67
3.3. HOMODIMERISIERUNG VON PEX26 69
3.3.1. CHARAKTERISIERUNG DER NEU IDENTIFIZIERTEN PPI: HOMODIMERISIERUNG
VON PEX26 69
3.3.2. INTRAZELLULAERE LOKALISATION DER VENUS-FUSIONSPROTEINE VON PEX26
70
3.3.3. EINGRENZUNG DER INTERAKTIONSDOMAENE AN VERKUERZTEN
PEX26-KONSTRUKTEN 70
3.3.4. UNTERSUCHUNG DER SPLICE-VARIANTE PEX26 DELTA-EXONS 72
3.3.4.1. KLONIERUNG VON PENTR PEX26AEX5 MITTELS IN-FUSION* PCR CLONING
SYSTEM
(CLONTECH) 72
3.3.4.2. INTERAKTIONEN DER PEX26AEX5 SPLICE-VARIANTE 73
4. DISKUSSION 76
4.1. AUFBAU DES BRET-BASIERTEN IN WVO-HOCHDURCHSATZ VERFAHRENS 76
4.2. EVALUIERUNG DER METHODE DURCH BESTAETIGUNG POSITIVER UND NEGATIVER
PPI 78
4.3. HOMODIMERISIERUNG VON PEX26 80
4.4. DIMERISIERUNG VON PEX26AEX5 80
4.5. BEDEUTUNG DER PEX26-HOMODIMERISIERUNG 81
4.6. AUSBLICK ZUR BEDEUTUNG DER PEX26-DIMERISIERUNG 85
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 87
TABELLENVERZEICHNIS 89
LITERATURVERZEICHNIS 90
DANKSAGUNG 99
VII
|
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spelling | Schatz, Ulrich Andreas Verfasser aut Aufbau eines Systems zur Untersuchung peroxisomaler Protein-Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle mittels Biolumineszenz Resonanzenergietransfer Ulrich Andreas Schatz 2014 XI, 99 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 2014 Langzeitarchivierung gewährleistet, LZA (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:19-169884 Erscheint auch als Druck-Ausgabe Schatz, Ulrich Andreas Aufbau eines Systems zur Untersuchung peroxisomaler Protein-Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle mittels Biolumineszenz Resonanzenergietransfer https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-169884 Resolving-System kostenfrei Volltext http://d-nb.info/1058076590/34 Langzeitarchivierung Nationalbibliothek DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=027574381&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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