Untersuchung des nicht-viralen Gentransfers mit den Polymeren PEI und PDMAEMA:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Berlin
Köster
2012
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| Edition: | 1. Aufl. |
| Series: | Wissenschaftliche Schriftenreihe Bioprozesstechnik
3 |
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | III, 162 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.EINLEITUN G 1
1.1. GENTHERAPIE UND BIOTECHNOLOGIE 1
1.2. TRANSFEKTION 1
1.2.1. MIKROINJEKTION UND ELEKTROPORATION 2
1.2.2. VIRALER GENTRANSFER 2
1.2.3. NICHT-VIRALER GENTRANSFER 3
1.2.3.1. LIPID-VERMITTELTE TRANSFEKTION 3
1.2.3.2. POLYMER-VERMITTELTE TRANSFEKTION 3
1.2.3.2.1. TRANSFEKTION M I T PEI 4
1.2.3.2.2. TRANSFEKTION M I T PDMAEMA 5
1.3. PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 6
2. IN VITRO ANALYSEN VON POLYPLEXEN 8
2.1. EINLEITUNG 8
2.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 1 1
2.2.1. GROESSE UND BESCHAFFENHEIT V O N POLYPLEXEN UND POLYMEREN 1 1
2.2.1.1. GROESSENVERTEILUNG D E R POLYPLEXE UND FREIER POLYMERE 1 1
2.2.1.2. STRUKTUR UND BESCHAFFENHEIT D E R POLYPLEXE 13
2.2.2. OBERFLAECHENLADUNG D E R POLYPLEXE 15
2.2.3. PUFFERKAPAZITAET D E R POLYMERE 16
2.2.4. UNTERSUCHUNG D E R POLYPLEXSTABILITAET 19
2.2.4.1. ETABLIERTE M E T H O D E N D E R UNTERSUCHUNG D E R
POLYPLEXSTABILITAET 19
2.2.4.2. AT ASSAY ZUR UNTERSUCHUNG D E R POLYPLEXE 20
2.2.4.3. EINFLUSS VON POLYMER ARCHITEKTUREN UND PDNA TOPOLOGIE 2 1
2.2.4.4. EINFLUSS DER QUATERNISIERUNG VON POLYMEREN 23
2.2.4.5. EINFLUSS DER POLYMERKONZENTRATION 25
2.2.5. HYPOTHESE ZUR BILDUNG VON POLYPLEXEN 26
2.2.6. FREISETZUNG D E R PDNA M I T POLYANIONEN 27
2.2.7. KOMPLEXIERUNG ALS SCHUTZ V O R DNASEN 29
2.3. ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE 30
3. UNTERSUCHUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ UND TOXIZITAET VON PDMAEMA 32
3.1. EINLEITUNG 32
3.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 34
3.2.1. LINEARES UND STERNFOERMIGES PDMAEMA 3 4
3.2.2. UNTERSUCHUNG D E R TOXIZITAET 35
3.2.3. UNTERSUCHUNG D E R TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ VON PDMAEMA 3 8
3.2.4. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN TRANSFEKTION UND TOXIZITAET 4 1
3.2.5. PDMAEMA I M VERGLEICH ZU PEI 4 3
3.3. ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE 44
4. UNTERSUCHUNG DER INTERNALISIERUNG UND DES INTRAZELLULAEREN TRANSPORTES
VON POLYPLEXEN 4 6
4.1. EINLEITUNG 46
4.1.1. ZELLULAERE AUFNAHME UND INTERNALISIERUNG 4 6
4.1.2. ENDOZYTOSE UND INTRAZELLULAERE VORGAENGE 4 7
4.1.3. AUFNAHME IN DEN ZELLKERN 4 9
4.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 50
4.2.1. MIKROSKOPISCHE LOKALISATIONSSTUDIEN 5 0
4 . 2 . 1 . 1 / LOKALISATION VON PEI UND PDMAEMA 5 0
4.2.1.2. GELANGEN DIE POLYMERE IN DEN KERN? 5 4
4.2.1.3. LOKALISATION D E R PDNA 5 6
4.2.2. KINETISCHE ANALYSEN VON PDMAEMA UND PEI POLYPLEXEN 5 8
4.2.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR CLATHRIN-ABHAENGIGEN ENDOZYTOSE 6 1
4.2.3.1. UNTERSUCHUNG D E R TRANSFEKTION M I T QUATERNISIERTEN POLYMEREN
6 1
4.2.3.1.1. TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ VON QUATERNISIERTEN POLYMEREN 6 1
I
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IMAGE 2
4.2.3.1.2. TOXIZITAET VON QUATERNISIERTEN POLYMEREN 63
4.2.3.1.3. LOKALISATION DER QUATERNISIERTEN POLYMERE 65
4.2.3.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR ENDOSOMENLYSE 6 6
4.2.3.2.1. EINFLUSS VON CHLOROQUIN UND BAFILOMYCIN A U F DIE
TRANSFEKTION 6 7
4.2.3.2.2. INTRAZELLULAERER PH W E R T DER POLYMERE BEI EINER
TRANSFEKTION 7 0
4.2.4. BILDUNG VON LOECHERN IN D E R ZELLMEMBRAN 72
4.3. ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE 75
5. STERNFOERMIGES PDMAEMA M I T VIELEN UND LANGEN ARMEN 79
5.1. EINLEITUNG 79
5.1.1. IMMORTALISIERTE ZELLEN 8 0
5.1.2. DIFFERENZIERTE UND PRIMAERE ZELLEN 8 1
5.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 83
5.2.1. UNTERSUCHUNGEN D E R TRANSFEKTION 8 3
5.2.1.1. TRANSFEKTIONEN VON IMMORTALISIERTEN, ADHERENTEN ZELLEN 8 4
5.2.1.2. TRANSFEKTIONEN V O N IMMORTALISIERTEN ZELLEN IN SUSPENSION 8 6
5.2.1.3. TRANSFEKTIONEN VON DIFFERENZIERTEN ADHERENTEN ZELLEN 8 7
5.2.1.4. TRANSFEKTIONEN V O N DIFFERENZIERTEN ZELLEN IN SUSPENSION 9 1
5.2.1.5. WEITERE VARIANTEN VON STERNFOERMIGEM PDMAEMA 95
5.2.2. UNTERSUCHUNG D E R TOXIZITAET V O N ST-PDMAEMA 230_20 U N D PEI 9
6
5.2.3. DER TRANSPORT VON ST-PDMAEMA 230.20 POLYPLEXEN 9 7
5.2.3.1. UNTERSUCHUNG D E R GROESSE UND BESCHAFFENHEIT D E R POLYPLEXE 9 7
5.2.3.2. UNTERSUCHUNG D E R OBERFLAECHENLADUNG UND PUFFERKAPAZITAET 9 8
5.2.3.3. OBERFLAECHENPROTEINE F UE R DIE AUFNAHME D E R POLYPLEXE 9 9
5.2.3.4. LOKALISATION VON ST-PDMAEMA 230.20 1 0 0
5.3. ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE 101
6. ANWENDUNGEN VON STERNFOERMIGEM PDMAEMA M I T MAGNETISCHEM KERN 105
6.1. EINLEITUNG 105
6.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 107
6.2.1. TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ VON NP@PDMAEMA 46 1 0 7
6.2.2. MAGNETISCHE EIGENSCHAFTEN V O N TRANSFIZIERTEN ZELLEN 108
6.2.3. MAGNETISCHE AUFREINIGUNG VON INTRAZELLULAEREN PROTEINEN 110
6.2.4. AUFREINIGUNG VON POLYPLEXEN 112
6.2.4.1. GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 113
6.2.4.2. MAGNETISCHE AUFREINIGUNG VON POLYPLEXEN 114
6.2.4.3. TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ VON ISOLIERTEN POLYPLEXEN 115
6.2.4.3.1. PEI UNS ST-PDMAEMA 100-3 115
6.2.4.3.2. NP@PDMAEMA 46 1 1 7
6.3. ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE 117
7. ZUSAMMENFASSUNG 120
8. SUMMARY 122
9. ANHANG 124
9.1. MATERIAL UND METHODEN 124
9.1.1. VERWENDETE CHEMIKALIEN U N D GERAETE 124
9.1.1.1. VERBRAUCHSMATERIALEN UND CHEMIKALIEN 124
9.1.1.2. GERAETE 1 2 4
9.1.1.3. VERWENDETE POLYMERE 125
9.1.1.4. ENZYME, SEREN UND ANTIKOERPER 126
9.1.2. MEDIEN UND PUFFER V 1 2 7
9.1.3. STATISTISCHE ANALYSEN 128
9.1.4. ANALYSE DES POLYMER-DNA-KOMPLEXES 128
9.1.4.1. BILDUNG V O N POLYPLEXEN 128
9.1.4.2. GELRETARDATIONSASSAY (GRA) 128
9.1.4.3. ETHIDIUMBROMIDVERDRAENGUNGSASSAY (EBA) 129
9.1.4.4. AT ASSAY 129
9.1.4.5. VERDRAENGUNG D E R PDNA DURCH POLYANIONEN 129
II
IMAGE 3
9.1.4.6. DNASE 1 ASSAY D E R POLYPLEXE 129
9.1.4.7. ZETAPOTENTIAL MESSUNGEN 130
9.1.4.8. DYNAMISCHE LICHTSTREUUNG (DLS) 130
9.1.4.9. TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (CRYO-TEM) 130
9.1.4.10. RASTERKRAFTMIKROSKOPIE (AFM) 130
9.1.5. ANALYTISCHE M E T H O D E N ZUR AUFREINIGUNG UND ISOLIERUNG 1 3 1
9.1.5.1. GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE (SEC) 1 3 1
9.1.5.2. MAGNETISCHE POLYPLEXISOLIERUNG 1 3 1
9.1.5.3. MAGNETISCHE ZELLISOLIERUNG 1 3 1
9.1.5.4. MAGNETISCHE AUFREINIGUNG VON INTRAZELLULAEREN PROTEINEN 1 3 1
9.1.5.4.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 132
9.1.6. MIKROBIOLOGISCHE M E T H O D E N 132
9.1.6.1. STAMMHALTUNG VON E. COLI 132
9.1.6.2. TRANSFORMATION CHEMISCH K O M P E T E N T E R BAKTERIEN 132
9.1.6.3. PLASMIDPRAEPARATION 133
9.1.7. ZELLBIOLOGISCHE M E T H O D E N 134
9.1.7.1. STAMMHALTUNG 134
9.1.7.1.1. ERNTE UND STAMMHALTUNG ADHERENTER ZELLEN 134
9.1.7.1.2. STAMMHALTUNG VON SUSPENSIONSZELLEN 135
9.1.7.1.3. KONSERVIERUNG IN STICKSTOFF 135
9.1.7.2. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON HUMANEN T-LYMPHOZYTEN 135
9.1.7.3. TRANSFEKTIONEN 136
9.1.7.3.1. ADHERENTE ZELLEN 136
9.1.7.3.2. SUSPENSIONSZELLEN 136
9.1.7.4. DURCHFLUSSZYTOMETRIE.. ... 136
9.1.7.4.1. MESSUNG D E R TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 138
9.1.7.4.2. ANTIKOERPERFAERBUNG V O N T-LYMPHOZYTEN 138
9.1.7.4.3. ZELLZYKLUSANALYSE 138
9.1.7.4.4. PH MESSUNG D E R UMGEBUNG VON POLYPLEXEN 139
9.1.7.4.5. LOCH ASSAY BEI TRANSFIZIERTEN ZELLEN 139
9.1.7.5. FLUORESZENZMIKROSKOPIE 140
9.1.7.5.1. FIXIERUNG D E R ZELLEN 140
9.1.7.5.2. MARKIERUNG D E R DNA 140
9.1.7.5.3. ANTIKOERPERFAERBUNG V O N PROTEINEN 1 4 1
9.1.7.6. ZYTOTOXIZITAETSTEST {MTT) 1 4 1
9.1.7.6.1. REL. VITALITAET BEI ADHERENTEN ZELLEN 1 4 1
9.1.7.6.2. REL. VITALITAET NACH ISO 10993-5 (ISO 2009) 142
9.1.7.6.3. REL. VITALITAET BEI ADHERENTEN ZELLEN 142
9.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 143
9.3. TABELLENVERZEICHNIS 148
9.4. LITERATURVERZEICHNIS 149
9.5. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 156
9.6. VEROEFFENTLICHUNGEN 158
9.7. LEBENSLAUF 160
9.8. DANKSAGUNG 161
III
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