Konstruktion von FV-Expressionsplasmiden zur kontinuierlichen FV-Vektorpartikelproduktion:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
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2000
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| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss., 2001 (Nur beschränkt für den Austausch) |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG. 1
1.1 FOAMYVIREN UND IHRE SONDERSTELLUNG IN DER RETROVIRUS-FAMILIE. 1
1.2 EIGNUNG FUER DIE GENTHERAPIE. 2
1.3 ZIELSETZUNG. 3
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 MATERIAL. 5
2.1.1 ANTIBIOTIKA. 5
2.1.2 ANTIKOERPER. 5
2.1.3 BAKTERIENSTAEMME. 5
2.1.4 CHEMIKALIEN. 6
2.1.5 ENZYME UND KITS. 6
2.1.6 GROESSENSTANDARDS. 6
2.1.7 MEDIEN. 7
2.1.8 PLASMIDE. 7
2.1.9 PRIMER. 8
2.1.10 PUFFER. 8
2.1.11 VIRUS. 10
2.1.12 ZELLINIEN. 10
2.2 METHODEN
2.2.1 DNA-TRANSFER IN BAKTERIENZELLEN. 11
2.2.1.1 DNA-TRANSFER IN BAKTERIENZELLEN (TRANSFORMATION). 11
2.2.1.1.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN FUER DIE TRANSFORMATION.
11
2.2.1.1.2 TRANSFORMATION VON
E. COLI-ZELLEN. 11
2.2.1.2 DNA-TRANSFER IN HOEHERE EUKARYOTE ZELLEN (TRANSFEKTION). 11
2.2.1.2.1 CA2+-PHOSPHAT TRANSFEKTION. 11
2.2.1.2.2 FUGENE
YY
6-TRANSFEKTION. 12
2.2.2 DNA-AUFREINIGUNG UND -AUFTRENNUNG. 12
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. CO//-ZELLEN. 12
2.2.2.2 PHENOLEXTRAKTION. 13
2.2.2.3 KONZENTRIERUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN. 13
2.2.2.4 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSE. 13
2.2.2.5 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN. 14
2.2.3 DNA-MODIFIKATIONEN IN VITRO. 14
2.2.3.1 SPALTUNG VON PLASMID-DNA (RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN). 14
2.2.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5'-PHOSPHATENDEN (SAP). 14
2.2.3.3 PHOSPHORYLIERUNG VON 5'-OH-ENDEN (PNK). 15
2.2.3.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN (T4 DNA-LIGASE). 15
2.2.3.5 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN (TAQ). 15
2.2.4 NACHWEIS ZELLULAERER PROTEINPRODUKTION. 16
2.2.4.1 IMMUNOLOGISCHE NACHWEISMETHODEN. 16
2.2.4.1.1 IMMUNFLUORESZENZ (IF).
1
6
2.2.4.1.2 WESTEMBLOT. 16
2.2.4.1.2.1 DISKONTINUIERLICHE SDS-PROTEINGELELKTROPHORESE. 16
2.2.4.1.2.2 PROTEINTRANSFER AUF NITROZELLULOSE-MEMBRANEN. 17
2.2.4.1.2.3 DETEKTION VON PROTEINEN (ANTIGENEN). 17
2.2.4.2 REVERSE TRANSCRIPTASE DETECTION ASSAY. 18
2.2.4.3 X-GAL-ASSAY (SS-GALAKTOSIDASE EXPRESSION). 18
2.2.5 ZELLKULTUR-ALLGEMEINE METHODEN.
19
2.2.5.1 AUFTAUEN VON ZELLEN.
19
2.2.5.2 KULTIVIERUNG UND SPLITTEN VON ZELLEN. 19
2.2.5.3 EINFRIEREN VON ZELLEN.
19
2.2.5.4 HAEMOCOLOR-FAERBUNG.
19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3 ERGEBNISSE
3.1 KONSTRUKTION VON Z E/-EXPRESSIONSPIASMIDEN.20
3.1.1 GENERELLE KLONIERUNGSSTRATEGIE. 20
3.1.1.1 DAS GRUNDPLASMID PSYN. 20
3.1.1.2 DARSTELLUNG DER KLONIERUNGSSTRATEGIE ANHAND VON
6E/-EXPRESSIONSPLASMIDEN. 20
3.1.2 KLONIERUNG EINES AEZ-SUPPORTERPLASMIDS. 22
3.1.2.1 INSERTION DER 6E/-TRANSKRIPTIONSEINHEIT IN EIN GEEIGNETES
GRUNDPLASMID. 22
3.1.2.2 EINFUEHRUNG EINES RESISTENZGENS UND EINES POLY A-ADDITIONSSIGNALS
IN PBEL 1. 23
3.1.2.3 HERSTELLUNG EINES INDUZIERBAREN 6E/-KONSTRUKTS. 25
3.1.2.3.1 HERSTELLUNG EINES INDUZIERBAREN CMV-PROMOTORS. 25
3.1.2.3.2 EINFUEHRUNG DES TRE/PCMV-PROMOTORS IN DAS FCE/-KONSTRUKT. 25
3.1.3 FUNKTIONELLER TEST DER 6E/-EXPRESSION. 27
3.2 KONSTRUKTION VON I/FV-EXPRESSIONSPLASMIDEN.29
3.2.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE. 29
3.2.2 ENV-EXPRESSIONSPIASMIDE. 29
3.2.2.1 KLONIERUNG VON PLTR IN PSYN-ENV. 29
3.22.2
EINFUEHRUNG EINES RESISTENZGENS IN DAS PPLTR-ENV PLASMID. 30
3.2.3 FUNKTIONELLER TEST DER ENV-EXPRESSION. 32
3.2.3.1 NACHWEIS VON ENV DURCH SUPERINFEKTION MIT HFV. 32
3.2.3.2 FUSION ENV-EXPRIMIERENDER ZELLEN MIT LYMPHOZYTEN. 34
3.3 KONSTRUKTION VON GA-EXPRESSIONSPLASMIDEN.35
3.3.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE. 35
3.3.2 GA-EXPRESSIONSPLASMIDE. 35
3.3.2.1 EINFUEHRUNG EINES POLY A-ADDITIONSSIGNALS IN PSYN. 35
3.3.2.2 EINFUEHRUNG VON
GAG. 35
3.3.2.3 EINFUEHRUNG DER PROMOTOREN PLTR UND PINT IN PGAG-POLY A. 36
3.3.2.3.1 HERSTELLUNG VON PINT DURCH PCR. 36
3.3.2.3.2 EINFUEHRUNG DER PROMOTOREN IN PGAG-POLY A. 37
3.3.3 FUNKTIONELLER TEST VON GAG. 37
3.4 KONSTRUKTION VON /W/-EXPRESSIONSPLASMIDEN.39
3.4.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE. 39
3.4.2 / O/-EXPRESSIONSPLASMIDE. 39
3.4.2.1 KLONIERUNG VON POL IN PSYN. 39
3.4.2.2 EINFUEHRUNG EINES POLY A-ADDITIONSSIGNALS. 40
3.4.2.3 EINFUEHRUNG DER PROMOTOREN PLTR UND PINT IN PPOL-POLY A. 40
3.4.3 FUNKTIONELLER TEST VON POL. 42
3.5 KONSTRUKTION VON GAG-POZ-EXPRESSIONSPIASMIDEN. 43
3.5.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE. 43
3.5.2 A-/ O/-EXPRESSIONSPLASINIDE. 43
3.5.2.1 EINFUEHRUNG DER PROMOTOREN PLTR UND PINT IN PGAG-POL. 43
3.5.3 FUNKTIONELLER TEST VON GAG UND POL. 45
3.5.4 MODIFIZIERUNG DES A-PO/-EXPRESSIONSPIASMIDS. 45
3.5.4.1 FUNKTIONELLER TEST DER GAG- UND /7O/-EXPRESSION. 45
INHALTSVERZEICHNIS
4 DISKUSSION
4.1 STRATEGIE DER VEKTORPARTIKELPRODUKTION. AL
4.2 VARIATIONSMOEGLICHKEITEN ZUR AKTIVIERUNG DER VEKTORVERPACKUNG. 49
4.3 EXPRESSION DER STRUKTURGENE. 53
4.3.1 ENV. 53
4.3.2 GAG UND POL. 55
4.4 VERGLEICH UND MOEGLICHKEITEN. 59
4.5 GENTHERAPIE UND AUSBLICK. 62
5 ZUSAMMENFASSUNG.63
6 LITERATURVERZEICHNIS. 64
7 ANHANG.69 |
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