Diagnostik der Herpes-simplex-Enzephalitis mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR):
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
WIDMUNG
DANKSAGUNG
WISSENSCHAFTLICHE
PUBLIKATIONEN
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
4
2.
EINLEITUNG
.
6
2.1
DAS
HERPES-SIMPLEX-VIRUS
.
6
2.1.1
EINTEILUNG
UND
AUFBAU
DER
HERPESVIREN
.
6
2.1.2
REPLIKATION
.
9
2.
1.
3
LATENZ
UND
REKURRENZ
.
11
2.
1.
4
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
DEM
HERPES-SIMPLEX-VIRUS
TYP
1
UND
TYP
2
.
11
2.1.5
EPIDEMIOLOGIE
.
12
2.2
DIE
HERPES-SIMPLEX-ENZEPHALITIS
.
14
2.2.1
KLINIK
DER
HERPES-SIMPLEX-ENZEPHALITIS
.
14
2.2.2
THERAPIE
.
16
2.
2.
3
DIAGNOSTIK
UND
DIFFERENTIALDIAGNOSE
.
17
2.
3
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
22
2.4
PROBLEMSTELLUNG
.
27
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
28
3.1
GERAETE
UND
ARBEITSMATERIALIEN
.
28
3.2
CHEMIKALIEN
.
30
3.3
ENZYME
.
31
3.
4
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
31
3.4.1
STAMMLOESUNGEN
.
31
3.4.
2
QIAAMP
KIT
.
33
3.4.
3
DIG
DNA
LABELING
AND
DETECTION
KIT
.
34
3.4.
3.1
DIG-REAGENZIEN
.
34
3.4.
3.
2
DIG-REAGENZIEN
(NEUANSAETZE)
.
35
3.4.4
GEN-ETI-K
DEIA
.
36
3.4.
5
ENZYMUN-TEST
DNA
DETECTION
.
37
3.5
OLIGONUKLEOTIDE
.
38
3.
5.1
OLIGONUKLEOTIDE
ALS
PRIMER
.
38
3.
5.2
OLIGONUKLEOTIDE
ALS
SONDEN
.
39
3.
5.
3
AUFREINIGUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
40
3.
5.4
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
DER
GELOESTEN
NUKLEINSAEUREN
.
40
3.
6
STERILISATION
DER
MATERIALIEN
.
42
2
3.
7
VIRUS
LABORSTAENUNE
.
42
3.
8
PLASMIDE
UND
COSMIDE
.
43
3.9
NEGATIVER
LIQUORPOOL
.
44
3.
10
DNA-EXTRAKTION
.
44
3.
10.
1.
1
EXTRAKTION
MIT
PROTEINASE
K
VERDAU
UND
ETHANOLFAELLUNG
.
45
3.
10.
1.
2
EXTRAKTION
MIT
NATRIUMJODID
.
45
3.
10.
1.
3
EXTRAKTION
MIT
CHELEX
100
.
46
3.
10.
1.4
EXTRAKTION
MIT
DEM
QIAAMP
KIT
.
46
3.
10.
2.
VORVERSUCHE
ZUR
ERMITTLUNG
DER
EXTRAKTIONSEFFIZIENZ
.
47
3.
10.
2.
1
VERGLEICH
DER
EXTRAKTIONSSENSITIVITAET
.
47
3.
10.
2.
2
INHIBITORENELIMINIERUNG
DER
EXTRAKTION
.
48
3.11
ENZYMATISCHE
SYNTHESE
DER
DNA
DURCH
DIE
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
49
3.11.1
MASTER
MIX
.
49
3.
11.2
REAKTIONSZEITEN
UND
TEMPERATUREN
.
51
3.12
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
52
3.
12.
1
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
52
3.
12.2
FAERBUNG
UND
ENTWICKLUNG
DER
POLYACRYLAMIDGELE
.
52
3.
12.
3
AGAROSE
GELELEKTROPHORESE
.
53
3.13
UEBERFUEHRUNG
VON
DNA
AUF
MEMBRANEN
(BLOTTING)
.
54
3.13.1
DOTBLOT
.
54
3.13.2
SOUTHERN
BLOT
.
55
3.14
MARKIERUNG
DER
SONDEN
.
56
3.
14.
1
DIGOXIGENIN
(DIG)
LABELING
DER
SONDEN
.
57
3.
14.
2
BIOTIN
MARKIERUNG
DER
SONDEN
.
59
3.
15
HYBRIDISIERUNG
.
60
3.
15.1
PRAEHYBRIDISIERUNG
.
60
3.
15.
2
HYBRIDISIERUNG
.
60
3.
15.
3
ENTFERNEN
UNSPEZIFISCH
GEBUNDENER
SONDEN
.
61
3.
15.4
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
MEMBRANGEBUNDENEN
HYBRIDISIERUNGEN
.
61
3.15.4.1
DIGOXIGENIN-FAERBUNG
.
61
3.
15.4.2
BIOTIN
FAERBUNG
.
62
3.15.5
DOKUMENTATION
DER
GELE UND
MEMBRANEN
.
62
3.16.
GEN-ETI-K
DEIA
.
63
3.
16.
1
SONDENKONZENTRATION
.
64
3.
16.
2
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR
.
65
3.16.3
SPEZIFITAETSKONTROLLE
.
65
3.
16.
4
SENSITIVITAET
DES
GEN-ETI-K
DEIA
.
66
3.16.5
INTERASSAY
UND
INTRAASSAY-V
ARIABILITAET
.
66
3.
16.
6
CUT-OFF-BESTIMMUNG
UND
ETABLIERUNG
DES
GEN-ETI-K
DEIA
.
66
3.
16.
7
ANSATZ
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
MIT
DEM
GEN-ETI-K
DEIA
.
67
3.17
ENZYMUN-TEST
DNA
DETECTION
.
68
3.
18
SPEZIFITAET
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
69
3.19
SENSITIVITAET
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
70
3.20
EVALUIERUNG
DER
METHODEN
AN
EINEM
PATIENTENKOLLEKTIV
.
71
3
4.
ERGEBNISSE
.
72
4.
1
SENSITIVITAET
DER
DNA-EXTRAKTION
IM
VERGLEICH
.
72
4.1.1
VORVERSUCHE
ZUR
DNA-EXTRAKTION
.
72
4.1.2
VERGLEICH
DER
EXTRAKTIONSSENSITIVITAET
.
74
4.1.3
INHIBITORENELIMINATION
DER
EXTRAKTIONEN
.
79
4.
2
SPEZIFITAET
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
81
4.
3
SENSITIVITAET
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
84
4.
4
ERGEBNISSE
DER
HSV-DNA-PCR
BEI
EINEM
PATIENTENKOLLEKTIV
MIT
ZNS-ERKRANKUNGEN
.
87
4.
5
HYBRIDISIERUNG
MIT
DEM
GEN-ETI-K
DEIA
.
89
4.
5.
1
SONDENKONZENTRATION
.
89
4.5.2
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR
.
90
4.5.3
SPEZIFITAET
DES
GEN-ETI-K
DEIA
.
91
4.
5.4
SENSITIVITAET
DES
GEN-ETI-K
DEIA
.
91
4.
5.
5
INTERASSAY
UND
INTRAASSAY-VARIABILITAET
.
93
4.5.6
CUT-OFF-BESTIMMUNG
UND
ETABLIERUNG
DES
GEN-ETI-K
DEIA
.
94
4.5.7
ANSATZ
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
MIT
DEM
GEN-ETI-K
DEIA
.
97
5.
DISKUSSION
.
98
5.1
AUFBEREITUNG
DER
PROBEN
.
98
5.2
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
102
5.
3
ANWENDUNG
DER
AUFBEREITUNG
MIT
CHELEX
100
UND
DER
PCR
AUS
DEM
POLYMERASE-GEN
AN
EINEM
PATIENTENKOLLEKTIV
.
105
5.
4
HYBRIDISIERUNG
MIT
DEM
GEN-ETI-K
DEIA
.
109
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
117
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
128
CURRICULUM
VITAE
.
131
EHRENWOERTLICHE
ERKLAERUNG
.
133 |
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