Aktivitäten des Nichtstrukturproteins 1 bei der Vermehrung von Influenza B Virus in humanen Zellen:
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2013
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DANKSAGUNG III
1 EINLEITUNG 1
1.1 DAS INFLUENZA VIRUS 1
1.1.1 TAXONOMIE 4
1.1.2 AUFBAU UND GENOMORGANISATION DES INFLUENZAVIRUSPARTIKELS 4
1.1.3 REPLIKATION 8
1.1.4 INFLUENZAVIREN UND APOPTOSE 10
1.1.5 STRUKTUR UND FUNKTION DES NICHTSTRUKTURPROTEINS 1 VON INFLUENZA A
UND B VIREN.. 15
1.2 DAS ZELLULAERE CHAPERON HSP90 19
1.3 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 22
2 MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 ZELLKULTUR 25
2.1.1 PASSAGIEREN VON ZELLEN 25
2.1.2 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 25
2.1.3 TRANSFEKTION VON SMALL INTERFERING (SI)RNA 26
2.2 INFEKTIOESE ARBEITEN 2 7
2.2.1 ANZUCHT VON INFLUENZA B VIREN IM HUEHNEREI 27
2.2.2 HAEMAGGLUTINATIONSTEST (HA-TEST) 27
2.2.3 INFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN MIT INFLUENZA B VIREN 28
2.2.4 TITERBESTIMMUNG MITTELS AVICEL-PLAQUE-ASSAY UND IMMUNFLUORESZENZ
29
2.2.5 HERSTELLUNG DER REKOMBINANTEN B/LEE VIREN P122/5L UND XSH3G 29
2.2.6 ISOLIERUNG VIRALER RNA 31
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 32
2.3.1 REVERSE TRANSKRIPTION (RT)-PCR 32
2.3.2 POLYMERASEKETTENREAKTION 32
2.3.3 SPALTUNG VON DNA MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 34
2.3.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DNA 35
2.3.5 REINIGUNG VON PCR-FRAGMENTEN 35
2.3.6 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS GELEXTRAKTION 35
2.3.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 35
2.3.8 TRANSFORMATION KOMPETENTER .CO// -BAKTERIEN DURCH HITZESCHOCK 36
2.3.9 PLASMIDPRAEPARATIONEN 36
2.3.10 DNA-SEQUENZIERUNG NACH SANGER. 37
2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 38
2.4.1 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN 38
IV
HTTP://D-NB.INFO/1051892058
2.4.2 PROTEIN-GELELEKTROPHORESE UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 38
2.4.3 FAERBEN UND TROCKNEN VON SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 39
2.4.4 WESTEMBLOT UND IMMUNODETEKTION 39
2.4.5 UEBEREXPRESSION VON GST-FUSIONSPROTEINEN IN E.COLI BL26-BAKTERIEN
39
2.4.6 KOPPLUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN AN GLUTATHION-SEPHAROSE 40
2.4.7 IN W FRO-TRANSLATION 40
2.4.8 INTERAKTIONSSTUDIEN 41
2.4.9 INTERFERON SS-ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 42
2.5 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 43
2.5.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZANALYSE 43
2.5.2 KONFOKALE LASER-SCANNING MIKROSKOPIE 43
2.5.3 ZYTOTOXIZITAETSTEST (MTT-TEST) 44
2.5.4 LUZIFERASE-REPORTERGEN-ASSAY 45
2.5.5 CASPASE-3/7-AKTIVITAETSTEST 45
2.6 MASSENSPEKTROMETRIE 46
2.6.1 INKORPORATION VON ISOTOPEN-MARKIERTEN AMINOSAEUREN IN A549-ZELLEN
46
2.6.2 INFEKTION VON SILAC-ZELLEN 47
2.6.3 ZELLLYSE, BCA-TEST UND KO-IMMUNOPRAEZIPITATION 47
2.6.4 REDUKTION, ALKYLIERUNG UND TRYPTISCHER VERDAU DER PROTEINE 47
2.6.5 MESSUNG MITTELS NANO-LC UND ORBITRAP 48
2.6.6 PEPTID- UND PROTEIN-IDENTIFIKATION UND -QUANTIFIZIERUNG 48
ERGEBNISSE 50
3.1 EINFLUSS DER HOCHKONSERVIERTEN AMINOSAEURESEQUENZ 121
-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127 IM
NS1
-PROTEIN AUF DIE REPLIKATION VON REKOMBINANTEN INFLUENZA B VIREN 50
3.1.1 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ
FUEHRT ZU
GESTEIGERTER REPLIKATION VON INFLUENZA B VIREN IN HUMANEN ZELLLINIEN 52
3.1.2 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ
FUEHRT ZU FRUEHER
VIRALER PROTEINSYNTHESE IM INFEKTIONSVERLAUF 54
3.1.3 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ
BESCHLEUNIGT
DIE RELOKALISIERUNG DER VIRALEN NS1- UND NP-PROTEINE WAEHREND DER
REPLIKATION 55
3.1.4 DIE SUBSTITUTIONEN IM 121-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIV DES
NS1-PROTEINS FUEHREN
ZU GESTEIGERTER VIRALER GENEXPRESSION IM VERGLEICH ZUM WT 57
3.1.5 DIE SUBSTITUTIONEN IM 121 -Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-AMINOSAEUREMOTIV
FUEHREN ZU
VERSTAERKTER INTERAKTION VON NS1 MIT VIRALEN POLYMERASEKOMPONENTEN 60
3.2 DAS 121-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIV HAT KEINEN EINFLUSS AUF
FAEHIGKEIT DER INTERFERON-
ANTAGONISIERUNG DES NS1-PROTEINS 61
V
3.3 DAS HOCHKONSERVIERTE 121 -Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIV VERMITTELT DIE
WECHSELWIRKUNG DES B/NS1-PROTEINS MIT DEM ZELLULAEREN ADAPTORPROTEIN
CRKLL. 63
3.3.1 B/NS1-CRK-LNTERAKTION IST FRUEH IM INFEKTIONSVERLAUF IM ZELLKERN
LOKALISIERT 64
3.3.2 DIE VERRINGERTE B/NS1-XSH3G-CRK-LNTERAKTION FUEHRT ZU GESTEIGERTER
JNK/ATF2-
SIGNALTRANSDUKTION IN INFIZIERTEN ZELLEN 66
3.3.3 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ
FUEHRT ZU
VERMINDERTER PI3K/AKT-SIGNALTRANSDUKTION ZU SPAETEN ZEITPUNKTEN DER
INFEKTION 67
3.3.4 CRK-NS1-INTERAKTION SPIELT NUR EINE GERINGE ROLLE BEI DER VIRALEN
REPLIKATION 69
3.4 DIE SUBSTITUTION DES GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIVS IM
NS1-PROTEIN FUEHRT
ZU VERSTAERKTER PHOSPHORYLIERUNG DER PROTEINKINASE R IM INFEKTIONSVERLAUF
71
3.4.1 DIE SUBSTITUTIONEN IN DER 121-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ HABEN
KEINEN
EINFLUSS AUF B/NS1-PKR-LNTERAKTION... 73
3.4.2 PKR-KNOCKDOWN HAT NUR GERINGE AUSWIRKUNGEN AUF DIE INFLUENZA B
VIRUSREPLIKATION 74
3.5 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-SEQUENZ IM
B/NS1-PROTEIN
FUEHRT ZU GESTEIGERTER APOPTOSE DER INFIZIERTEN ZELLEN 76
3.5.1 EINE CASPASE 3-LNHIBITION HAT NUR GERINGE FOLGEN FUER DIE
REPLIKATION DER INFLUENZA
B VIREN MIT MUTATIONEN IM NS1-121-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIV 79
3.6 EIN GLOBALER ANSATZ ZUR BESCHREIBUNG DES INTERAKTOMS VON NS1-WT-
BZW. XSH3G-
PROTEINEN IDENTIFIZIERT HSP90SS ALS DIFFERENZIELLEN BINDUNGSPARTNER. 80
3.6.1 DETEKTION DER HSP90SS-NS1 -INTERAKTION MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE
80
3.6.2 DIE SUBSTITUTIONEN IM AS-MOTIV 121-Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127 FUEHREN ZU
VERSTAERKTER
INTERAKTION DES NS1-PROTEINS MIT DEM CHAPERON HSP90SS 85
3.6.3 DIE SUBSTITUTION DES GESAMTEN NS1-122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIVS
FUEHRT ZU
GESTEIGERTER ASSOZIATION VON HSP90SS MIT NS1 UND PB2 IN DER INFEKTION 86
3.6.4 INHIBITION VON HSP90 VERRINGERT DIE VERMEHRUNG VON INFLUENZA B
VIREN 87
4 DISKUSSION 89
4.1 DIE SUBSTITUTION DER GESAMTEN 122-P-X-X-P-X-(KJR)-127-SEQUENZ IM
B/NS1-PROTEIN
FUEHRT DURCH VERSTAERKTE HSP90-PB2-BINDUNG ZU GESTEIGERTER REPLIKATION VON
INFLUENZA B
VIREN IN HUMANEN ZELLLINIEN
90
4.2 B/NS1 BINDET UEBER DAS SEQUENZMOTIV 121 -Y-P-X-X-P-X-(K/R)-127 DAS
ADAPTORPROTEIN
CRK UND SUPPRIMIERT DEN JNK/ATF2-SIGNALWEG 96
4.3 DIE VOLLSTAENDIGE SUBSTITUTION DES 122-P-X-X-P-X-(K/R)-127-MOTIVS
FUEHRT ZU
GESTEIGERTER PKR-AKTIVIERUNG UND APOPTOSEINDUKTION IN INFIZIERTEN ZELLEN
98
5 ZUSAMMENFASSUNG 103
6 SUMMARY 104
VI
LITERATURVERZEICHNIS 107
ANHANG 116
1. MATERIALVERZEICHNIS 116
EIN- UND DREI-BUCHSTABEN-CODE DER AMINOSAEUREN 127
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 127
VII
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