C - G Transversion im Exon A an Position 77 des CD45 Gens und Diabetes mellitus Typ 1:
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2008
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Autor: Rosenhahn, Susanne
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis III
Inhaltsverzeichnis V
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 3
2.1 Das Krankheitsbild des Diabetes mellitus, speziell des Diabetes mellitus Typ 1 5
2.2 Merkmale der Biologie des CD45 Molekülsystems 9
2.2.1 Der schematische Aufbau des transmembranösen Glykoproteins CD45 . 10
2.2.2 Das CD45 Molekül: einige Aspekte zur Funktion und Funktions¬
regulation 12
2.2.3 Detektion der verschiedenen CD45 Isoformen durch mAk 13
2.2.4 Der Prozess des alternativen Spleißens im CD45 Molekülsystem und
Veränderungen des Spleißprozesses durch Mutationen 14
2.2.5 Punktmutationen im CD45 Gen und Assoziationen zu Autoimmun¬
erkrankungen 18
3. Ziele der Arbeit 20
4. Materialien 21
4.1 Chemikalien 21
4.2 Verbrauchsmaterial 22
4.3 Geräte 23
4.4 Antikörper 24
4.5 Probenmaterial 26
4.6 Primer für die Polymerase-Kettenreaktion 28
4.7 Restriktionsendonuklease Msp I 28
5. Experimentelle Methoden 29
5.1 Herstellung von Lösungen 29
5.1.1 Herstellung von Phosphat-Puffer-Lösung (PBS) 29
5.1.2 Herstellung von einfach konzentrierter Lyselösung
(FACS Lysing Solution) 29
5.2 Durchflusszytometrische Analytik 29
5.2.1 Prinzip der Durchflusszytometrie 29
5.2.2 Färbeansätze für die durchflusszytometrischen Messungen 32
5.3 Molekulargenetische Analyse 35
v
5.3.1 Isolierung von DNA aus Vollblut 35
5.3.2 Quantifizierung der extrahierten DNA am Photometer 38
5.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38
5.3.4 RFLP-(Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) Analyse 41
5.3.5 Zubereitung der Gellösungen 42
5.3.6 Elektrophorese der PCR-RFLP-Produkte 43
5.3.7 Fotodokumentation der Agarosegele 45
6. Statistische Methoden 46
7. Ergebnisse 47
7.1 Durchflusszytometrische Analytik 47
7.1.1 Darstellung der verschiedenen Leukozytenpopulationen im durchflusszyto-
metrisch aufgenommenem Punktediagramm aus einer Vollblutprobe ... 47
7.1.2 Konzentrationsbestimmung für die einzelnen monoklonalen CD45
Antikörper mittels einer Verdünnungsreihe 49
7.1.3 Isotypkontrollen für die einzelnen ausgewählten monoklonalen CD45
Antikörper und für den monoklonalen Sekundärantikörper 53
7.1.4 Durchflusszytometrische Analysen des CD45RA, CD45R0 und CD45RC
Expressionsmusters auf Lymphozyten von Patienten/innen mit Diabetes
mellitus Typ 1 und gesunden Kontrollindividuen 55
7.2 Molekulargenetische Analyseergebnisse 64
7.2.1 Darstellung der PCR-RFLP Analyse zum Nachweis der Punktmutation
inExon A des CD45 Gens 64
7.2.2 Nachweis der C-»G Transversion an Position 77 von Exon A des CD45
Gens bei den Studienindividuen 66
7.2.3 Darstellung der Allelfrequenzen im Vergleich 69
7.2.4 Berechnen des Auftretens eines homozygoten Merkmalträgers nach dem
HARDY-WEINBERG-Gesetz 69
7.2.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 72
8. Diskussion 73
8.1 Chromosomenregionen und deren Bedeutung für Diabetes mellitus Typ 1 74
8.2 CD45 77G-Allelfrequenz und Erkrankung Diabetes mellitus Typ 1 76
8.3 Immunologie des Diabetes mellitus Typ 1 und die C—»G Transversion 79
8.4 Die Anwendbarkeit des HARDY-WEINBERG-Gesetzes auf das Variante
CD45RA Expressionsmuster 81
VT
8.5 Das CD45RC Expressionsmuster im untersuchtem Patienten- und Kontroll¬
kollektiv 83
9. Schlussfolgerungen 87
Literatur- und Quellenverzeichnis VIII
Anhang XXII
Ehrenwörtliche Erklärung XXII
Lebenslauf mit bisheriger wissenschaftlicher Tätigkeit XXIII
Danksagung XXV
Votum der Ethikkommission XXVI
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