Herstellung mono- und polyklonaler KIBRA-Antikörper:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2013
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | [6], VIII, 77 Bl. Ill. 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DAS PROTEIN K1BRA 1
1.2 FUNKTION VON K1BRA 3
1.3 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELE 7
2 MATERIAL 8
2.1 GERAETE 8
2.2 CHEMIKALIEN 9
2.3 STAMMLOESUNGEN UND PUFFER 10
2.4 MEDIEN 11
2.4.1 MEDIEN ZUR KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 11
2.4.2 MEDIEN ZUR KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 12
2.5 REAGENZIENSYSTEME 12
2.6 ENZYME UND MARKER 13
2.6.1 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 13
2.6.2 SONSTIGE ENZYME 14
2.6.3 MARKER 14
2.7 IMMUNOLOGISCHE REAGENZIEN 14
2.7.1 PRIMAERE ANTIKOERPER 14
2.7.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 14
2.8 PRIMER 15
2.8.1 KLONIERUNGSPRIMER 15
2.8.2 SEQUENZIERPRIMER FUER PCR4TOPO 16
2.9 VEKTOREN 16
2.9.1 PROKARYOTISCHE EXPRESSIONSVEKTOREN 16
2.9.2 HERGESTELLTE PROKARYOTISCHE EXPRESSIONSVEKTOREN 16
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II
2.10 ORGANISMEN 18
2.10.1 BAKTIERIENSTAEMME 18
2.10.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN 18
3 METHODEN 19
3.1 ANZUCHT, KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON BAKTERIEN UND EUKARYOTISCHEN
ZELLEN 19
3.1.1 STAMMHALTUNG VON BAKTERIEN (E. CO/Z-DERIVATE TOP 10, DH5A, BL21)
19
3.1.2 ANZUCHT, KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN
(HEK293) 19
3.2 ARBEITEN MIT DNA 20
3.2.1 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) ZUR HERSTELLUNG VON
KLONIERUNGSKONSTRUKTEN... 20
3.2.2 TOPO CLONING REAKTION 22
3.2.3 LIGATION 23
3.2.4 TRANSFORMATION IN CHEMISCH KOMPETENTE E. COLI 24
3.2.5 UEBERPRUEFUNG DER KLONIERUNG 25
3.2.6 PLASMIDISOLIERUNG AUS BAKTERIEN 25
3.2.7 RESTRIKTION VON DNA 25
3.2.8 AUFTRENNUNG DER DNA IM ELEKTRISCHEN FELD UND GELEXTRAKTION 26
3.2.9 SEQUENZIERUNG DER DNA 27
3.2.10 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 28
3.3 ARBEITEN MIT PROTEINEN 29
3.3.1 EXPRESSION VON PROTEINEN IN E. COLI BL21/DE3 29
3.3.2 AUFREINIGUNG HISTIDIN-MARKIERTER PROTEINE UNTER EINSATZ VON TALON
METALLIONEN-AFFINITAETSMATRIX .30
3.3.3 KONTROLLE DER PROTEINELUTIONEN, DEREN DIALYSE UND EINENGUNG 31
3.3.4 SDS-GELELEKTROPHORESE 32
3.3.5 PROTEINFAERBUNG MIT COOMASSIE BRILLIANT BLUE 32
3.3.6 DIE WESTERN BLOT ANALYSE 33
3.3.7 HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN 33
3.4 IMMUNISIERUNG 34
3.4.1 POLYKLONALE ANTIKOERPER 34
3.4.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER 37
3.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ AN NIEREN-KRYOSCHNITTEN 38
4 ERGEBNISSE 40
4.1 GEWINNUNG DES PROTEINS K1BRA 40
III
4.1.1 POLYMERASEKETTENREAKTION ZUR AMPLIFIKATION DER KIBRA FRAGMENTE 41
4.1.2 TOPO CLONING REAKTION UND TRANSFORMATION IN CHEMISCH KOMPETENTE
E. COLI TOPLO 41
4.1.3 SUBKLONIERUNG IN DEN VEKTOR PET24B 42
4.1.4 PROTEINEXPRESSION 44
4.1.5 EINENGUNG DER PROTEINELUTIONEN 46
4.1.6 WESTERN BLOT ANALYSEN DER ELUTIONEN MIT HISTIDIN-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN 48
4.2 ANTIKOERPERGEWINNUNG 48
4.2.1 GEWINNUNG UND TESTUNG EIGENER POLYKLONALER ANTIKOERPER 49
4.2.2 GEWINNUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER DURCH IMMUNOGLOBE 52
4.2.3 GEWINNUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER DURCH HYBRIDOMATECHNIK 53
4.3 EINSATZ DER GEWONNENEN ANTIKOERPER 55
4.3.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ AN MURINEN NIERENSCHNITTEN 55
4.3.2 KIBRA KNOCKOUT MAUS 56
4.3.3 KIBRA KNOCKDOWN ZELLLINIE 57
5 DISKUSSION 59
5.1 BEDEUTUNG DES PROTEINS KIBRA 59
5.2 DISKUSSION DER BESCHRIEBENEN ERGEBNISSE 60
5.2.1 PROTEINGEWINNUNG 60
5.2.2 SPEZIFITAET DER NEU GENERIERTEN ANTIKOERPER 61
5.2.3 EINSATZ DER NEU GENERIERTEN ANTIKOERPER 63
5.3 ZUKUENFTIGE EINSATZMOEGLICHKEITEN DER NEU GENERIERTEN ANTIKOERPER 64
5.3.1 KIBRA IN DER NEPHROLOGIE 64
5.3.2 KIBRA IN DER NEUROLOGIE 65
5.3.3 KIBRA UND DER SALVADOR/WARTS/HIPPO-SIGNALWEG 65
6 BIBLIOGRAPHIE 67
7 DANKSAGUNG 76
8 LEBENSLAUF. 77
|
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