Charakterisierung trans-regulatorischer Komponenten der Fettsäure-Synthase-Genexpression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
ZUSAMMENFASSUNG
7
II.
EINLEITUNG
8
III.
ERGEBNISSE
15
1.
KONSTRUKTION
EINER
INO4-LESERAHMENKASSETTE
15
2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSKRIPTIONALEN
AKTIVIERUNG
DURCH
DAS
INO4P-REGULATORPROTEIN
15
2.1.
INDIREKTE
GENAKTIVIERUNG
DURCH
EIN
LEXA
OBO
-LNO4P-HYBRIDPROTEIN
15
2.1.1.
KONSTRUKTION
EINES
LEXAOBO-LNO4P-FUSIONSPROTEMS
15
2.1.2.
KOMPLEMENTATION
EINER
AINO4-DISRUPTANTE
MIT
DEM
LEXA
OBD
-LNO4P-FUSIONSPOTEIN
19
2.1.3.
BIFUNKTIONALITAET
DES
FUSIONSPROTEINS
LEXA
0B0
-LNO4P
IN
EINER
AINO4-NUWMUTANTE
19
2.1.4
AUSFALL
DER
LEXA
0
BO
|
NO4P-BEDINGTEN
GENAKTIVIERUNG
IN
EINER
AINO2-NULLMUTANTE
21
2.1.5
REGULATIVE
ANSPRECHBARKEIT
DES
INO4P-PROTEINS
IN
FUSION
MIT
DER
DNA-BINDEDOMAENE
DES
BAKTERIELLEN
FEXA-REPRESSORS
21
2.2.
INDIREKTE
GENAKTIVIERUNG
DURCH
EIN
GAL4OB
O
-LNO4P-FUSIONSPROTEIN
25
2.2.1.
KONSTRUKTION
EINES
GAL4
DBD
-LNO4P-FUSIONSPROTEINS
25
2.2.2.
KOMPLEMENTATION
EINER
AINO4-DISRUPTANTE
MIT
DEM
GART
OBO
-LNO4P-FUSIONSPROTEIN
25
2.2.3.
GENAKTIVIERUNG
DURCH
EINE
GAL4
OAO
-/NO4-FUSION
25
3
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-BINDEDOMAENE
DES
INO4P-REGULATORS
28
3.1.
GELRETARDIERUNGSANALYSE
DES
LEXAO
BD
-LNO4P-FUSIONSPROTEINS
MIT
UAS
FAS
-PROBEN
28
3
2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
IN
VITRO
HERGESTELLTEN
MUTANTEN
DER
BASISCHEN
DOMAENE
DES
INO4P-PROTEINS
31
4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IN
VIVO
INTERAKTION
DES
INO4P-PROTEINS
MIT
DEM
INO2P-PROTEIN
38
4.1.
FUSION
VON
IN
VITRO
HERGESTELLTEN
AINO4-MUTANTEN
MIT
DER
HETEROLOGEN
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNGSDOMAENE
DES
GAL4-PROTEINS
38
4.2.
TEST
AUF
IN
VIVO
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
MUTIERTEN
GAL^^-INO^
UND
GAL4
DBD
-INO2
!
HLH
KONSTRUKTEN
IM
"TWO
HYBRID
SYSTEM
"
38
5.
EXPERIMENTE
ZUR
AUTOREGULATION
DES
REGULATORS
INO4P
44
5.1.
KLONIERUNG
DES
"VERLAENGERTEN"/NO4-PROMOTORS
44
5.2.
EINFLUSS
DES
VERLAENGERTEN
/NO4-PROMOTORS
AUF
DIE
REPORTERGEN-EXPRESSION
44
6.
VORARBEITEN
FUER
EXPERIMENTE
ZUR
INTRAZELLULAEREN
LOKALISIERUNG
DES
INO4P
49
6.1.
KONSTRUKTION
BIFUNKTIONELLER
/NO4-/ACZ-FUSIONSGENE
49
6.1.1.
KONSTRUKTION
EINER
/NO4-/ACZ-FUSION
UNTER
DER
KONTROLLE
DES
EIGENEN
PROMOTERS
49
6.1.2.
KONSTRUKTION
EINER
ADH1
PROM
-/NO4-/ACZ-FUSION
51
6.2.
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAETEN
IN
/NO4-/ACZ-TRANSFORMANTEN
51
6.3.
WESTERN-ANALYSE
DES
ADH1
PROM
-/NO4-/ACZ-FUSIONSGENPRODUKTES
51
6.4.
GELRETARDIERUNGS-ANALYSE
DER
LNO4-LACZ-FUSIONSPROTEINE
53
7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
WIRKUNGSWEISE
DES
OP/1-GENS
53
7.1.
KLONIERUNG
DES
OP/1-GENS
57
7.2.
HERSTELLUNG
VON
AOP/1-DISRUPTIONSKONSTRUKTEN
57
7.3.
INSERTION
EINER
KUENSTLICHEN
XHOL-SCHNITTSTELLE
IN
DIE
ECORV-SCHNITTSTELLE
IM
OP/1-GEN
57
8.
CHARAKTERISIERUNG
WEITERER
TRANS-FAKTOREN
DER
FETTSAEURE-SYNTHASE
GENEXPRESSION
IN
HEFE
60
8.1.
SEQUENZIERUNG
DES
RFA-FRAGMENTES
AUS
DEM
YEP24-KLON
PK30T2SAL
60
8.1.1.
UMKLONIERUNG
DES
DNA-FRAGMENTES AUS
PK30T2SAL
IN
PBLUESCRIPT
UND
PUC19
60
8.1.2.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DES
RFA-FRAGMENTES
IM
PLASMID
PKR51
63
8.1.3.
SUBKLONIERUNG
DES
RFA-FRAGMENTES
AUS
PKR51
UND
PKR52
63
8.1.4.
SEQUENZIERUNG
DES
2,3
KB
GROSSEN
DNA-FRAGMENTES
AUS
PKR51
66
8.2.
COMPUTERGESTUETZTE
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZIERTEN
DNA-REGION
68
8
2.1.
LESERAHMEN
INNERHALB
DER
SEQUENZIERTEN
DNA-REGION
68
8.2.2.
"TESTCODE''-PROFIL,
"CODON-PRAFERENZ'-PROFIL
UND
A+T
BZW.
G+C-GEHALT
DES
SEQUENZIERTEN
DNA-FRAGMENTES
AUS
S.
CEREVISIAE
77
8.2.3.
RESTNKTIONSSCHNITTSTELLEN
INNERHALB
DES
SEQUENZIERTEN
DNA-BEREICHS
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
78
8.3.
VERSUCHE
ZUR
KOMPLEMENTATION
DER
MUTANTE
K30
MIT
VERSCHIEDEN
LANGER
RFA
1-HALTIGEN
INSERTIONEN
78
8.3.1.
HERSTELLUNG
VON
SUBKLONEN
FUER
DIE
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
79
8.3.2.
UNTERSUCHUNG
DER
PLASMIDE
PKR54
UND
PKR58
DURCH
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
79
IV
DISKUSSION
91
V.
MATERIAL
UND
METHODEN
101
1.
GERATE
101
2.
CHEMIKALIEN
UND
LABORHILFSMITTEL
102
3.
ENZYME
103
4.
VERWENDETE
ORGANISMEN
103
4.1.
E.
CO/I-STAEMME
103
4.2.
SACCHAROMYCES
CEREV/S/AE-STAEMME
104
5.
NAEHRMEDIEN
104
5.1.
E.
COTF-KULTURMEDIEN
105
5.2.
S.
CEREV/S/AE-KULTURMEDIEN
105
6.
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
106
7.
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDPUFFER
108
8.
KULTIVIERUNG
VON
MIKROORGANISMEN
109
8.1.
ANZUCHT
VON
E.
CO/I-ZELLEN
109
8.2.
ANZUCHT
VON
HEFEZELLEN
109
8.3.
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
BEI
E.
COLI
UND
S.
CEREVISIAE-ZELLEN
109
9.
ZELLROHEXTRAKTE
AUS
HEFE
110
10.
PROTEINBESTIMMUNG
110
10.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
MIKROBIURET-METHODE
110
10.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
BRADFORD-METHODE
111
11.
SS-GALAKTOSIDASE-ENZYMTEST
111
12.
DNA-ISOLIERUNGEN
112
12.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
112
12.1.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
DEM
"QIAGEN-KIF
112
12.1.2.
PRAEPARATIVE
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
113
12.1.3
ANALYTISCHE
DNA-ISOLIERUNG
113
12.2.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
S.
CEREVISIAE
114
13.
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
115
14.
ELEKTROPHORETISCHE
TECHNIKEN
115
14.1.
ANALYTISCHE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
115
14.2.
PRAEPARATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
115
14.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
FUER
RETARDIERUNGSANALYSEN
116
14.4.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESEZUR
DNA-SEQUENZANALYSE
117
14.5.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
118
15.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
120
15.1.
ISOLIERUNG
NACH
DER
"FREEZE-SQUEEZE
"
-METHODE
120
15.2.
ISOLIERUNG
MIT
HILFE
DES
"QIAEX"-GELEXTRAKTIONSKITS
121
16.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNA
122
16.1.
RESTRIKBONSENDONUKLEASESPALTUNG
VON
DNA
122
16.2.
VERKUERZUNG
LINEARER
DNA-MOLEKUELE
MIT
BAL31-EXONUKLEASE
122
16.2.
LIGATION
VON
DNA
123
16.3.
LINKER-INSERTION
123
17.
IN
VITRO SYNTHESE
SPEZIFISCHER
DNA-FRAGMENTE
MIT
HILFE
VON
PCR
124
18.
T
RANSFORMATIONSTECHNIKEN
126
18.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
126
18.1.1.
TRANSFORMATION
NACH
DER
"CACIJ/RBCF-METHODE
126
18.1.2.
TRANSFORMATION
NACH
DER
"CACI
2
"-METHODE
126
18.2.
HEFETRANSFORMATION
127
18.2.1.
TRANSFORMATION
NACH
DER
LITHIUMACETAT-METHODE
127
18.2.2.
TRANSFORMATION
NACH
EINER
MODIFIZIERTEN
LITHIUMACETAT-METHODE
128
19.
DNA-SEQUENZ'IERUNG
129
19.1.
DENATUNERUNG
DES
DOPPELSTRANGES
129
19.2.
SEQUENZIER-REAKTIONEN
129
20.
HERSTELLUNG
EINES
PROTEINBINDUNGSEXTRAKTES
AUS
HEFE
130
21.
GELRETARDIERUNGSEXPENMENTE
131
21.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
EINES
DNA-FRAGMENTES
131
21.2.
PROTEIN-DNA-BINDUNGSREAKTION
132
22.
WESTERN-ANALYSE
132
22.1.
HERSTELLUNG
EINES
ZELLPROTEINEXTRAKTES
ZUR
WESTERN-ANALYSE
(HEISSER
AUFSCHLUSS)
132
22.2.
"WESTEM
'
-TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
AUF
NITROZELLULOSE
133
22.3.
IMMUNKOMPLEX-BILDUNG
UND
DESSEN
NACHWEIS
MITTELS
PROTEIN
A/MEERETTICH
PEROXIDASE
(HRP)-KONJUGAT
134
22.4.
NACHWEIS
DER
IMMUNKOMPLEX-BILDUNG
MITTELS
BIOLUMINESZENZ
135
VI.
ANHANG
136
ABKUERZUNGEN
136
LITERATURVERZEICHNIS
138 |
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