Nachweis und Typisierung von konventionellen Hühneradenoviren und dem Egg Drop Syndrome Virus mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion kombiniert mit Restriktionsenzymanalyse:
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Autor: Raue, Rüdiger
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Seite
Inhaltsverzeichnis.......................................................5
Abkürzungen.................................................................9
I. Einleitung..........................................................12
II. Ziel der Arbeit..................................................26
III. Material und Methoden....................................28
1. Zellkulturen...............................................................................................28
1.1. Hühnerembryoleberzellkulturen..................................................................28
1.2. Lösungen für die Zeilkulturpräparation.......................................................29
2. Virusanzucht und -Vermehrung...............................................................29
2.1. Herstellung von Organ- und Kothomogenisaten.........................................29
2.2. Virusanzucht und -Vermehrung...................................................................29
3. Virusmaterial.............................................................................................30
3.1. Referenzstämme........................................................................................30
3.2. Feldstämme................................................................................................31
4. Probenmaterial..........................................................................................33
4.1. Organmaterial.............................................................................................33
4.2. Hydroperikardflüssigkeit.............................................................................33
4.3. Kotproben...................................................................................................35
5. Virusreinigung und DNS-Präparation.....................................................35
5.1. Virusreinigung und Gewinnung der DNS bei den Referenzstämmen.........35
5.2. Phenol-Chlorofbrrn-Extraktion.....................................................................36
Inhaltsverzeichnis 6
Ethanolfällung.............................................................................................37
DNS-Konzentrationsmessung.....................................................................37
DNS-Präparation mit dem QlAamp Tissue Kits8.........................................37
DNS-Präparation aus Isolaten....................................................................38
DNS-Präparation aus Organhomogenisaten..............................................39
DNS-Präparation aus Organproben...........................................................39
DNS-Präparation aus Hydroperikardflüssigkeit..........................................40
DNS-Präparation aus Kotproben................................................................41
Phenol-Chloroform-Extraktion mit Ethanolfällung.......................................41
Lösungen für die Virusreinigung und die DNS-Präparation........................41
6. Computergestützte Homologiestudien...................................................42
6.1. Computerprogramme für die Homologiestudien.........................................42
6.2. Hexonsequenzen........................................................................................42
6.3. Strukturanalysen und Homologiestudien der Hexone.................................43
7. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..........................................................43
7.1. Primerdesign...............................................................................................43
7.2. Allgemeine Anmerkungen zur Präparation der PCR..................................44
7.3. DerPCR-Kit................................................................................................45
7.4. Thermozyklerbedingungen.........................................................................46
8. Gelelektrophorese der PCR-Produkte....................................................47
8.1. Gelelektrophorese der PCR-Produkte........................................................47
8.2. Lösungen für die Gelelektrophorese...........................................................48
9. Restriktionsenzymanalyse (REA)............................................................48
9.1. Allgemeine Anmerkungen zur REA............................................................48
9.2. REA der H1/H2-PCR-Produkte...................................................................49
9.3. REA der H3/H4-PCR-Produkte...................................................................49
9.4. Gelelektrophorese der REA........................................................................50
9.5. Lösungen für die REA.......................................................... 50
10. Bestimmung der Nachweisgrenzen........................................................51
10.1. Allgemeine Bemerkungen zur Bestimmung der Nachweisgrenzen............51
Inhaltsverzeichnis 7
10.2. Auswahl der FAV-Serotypen......................................................................51
10.3. PCR und PCR-Produktaufreinigung für die DNS-Sondenherstellung.........51
10.4. Herstellung der DNS-Sonden.....................................................................53
10.5. Herstellung der Verdünnungsreihen der Vetreter der DNS-Typen.............53
10.6. Bestimmung der Nachweisgrenzen mittels Agarosegel..............................53
10.7. Bestimmung der Nachweisgrenzen mittels Dot Blot-Hybridisierung...........54
10.8. Hybridisierung.............................................................................................54
10.9. Chemilumineszens.....................................................................................55
10.10. Lösungen für die Dot Blot-Hybridisierung...................................................55
11. Untersuchungen zur Beeinflussung der Nachweisgrenzen durch
Komponenten in Organ- oder Kotproben...............................................57
11.1. Untersuchungen zum Einfluß der Gesamt-DNS auf die PCR.....................57
11.2. Untersuchungen zum Einfluß von Inhibitoren im Geflügelkot.....................58
11.2.1. Herstellung der Virusverdünnungsreihe......................................................58
11.2.2. Herstellung der Virus-Kotsuspension..........................................................58
11.2.3. Durchführung der PCR in der Virus-Kotsuspension...................................59
IV. Ergebnisse.........................................................60
1. Die Homologiestudien..............................................................................60
2. Die Primerbindungsstellen......................................................................68
3. Ergebnisse der PCRs zum Nachweis von FAV......................................70
3.1. Nachweis von FAV-DNS mit Hilfe der H1/H2-PCR.....................................70
3.2. Haell-Spaltung der H1/H2-PCR-Produkte..................................................71
3.3. Nachweis von FAV-DNS mit Hilfe der H3/H4-PCR.....................................72
3.4. tfpall-SpaKung der H3/H4-PCR-Produkte..................................................73
4. Nachweis der EDS Virus-DNS mit Hilfe der H5/H6-PCR........................75
5. Bestimmung der Nachweisgrenzen_________.......................................76
5.1. Berechnung der Genomäquivatente...........................................................76
5.2. Bestimmung der Nachweisgrenzen der H1/H2-PCR..................................76
5.3. Bestimmung der Nachweisgrenzen der H3/H4-PCR..................................79
Inhaltsverzeichnis
Untersuchungen an FAV-Feldisolaten....................................................81
FAV4-Feldisolate........................................................................................81
FAV-Feldisolate von Hühnern.....................................................................84
FAV-Feldisolate von unterschiedlichen Vogelarten....................................88
Untersuchungen an EDS Virusstämmen....................................................92
7. Untersuchung an Organproben...............................................................94
7.1. Nachweis von FAVaus unterschiedlichen Organen...................................94
7.2. Nachweis von FAV aus Organproben bei Verwendung
unterschiedlicher Infektionsmodi.................................................................97
8. Bestimmung der FAV-Nachweisgrenzen bei verschiedenen
Probenmaterialien....................................................................................99
8.1. Untersuchungen zum Einfluß zellulärer DNS bei Organproben..................99
8.2. Untersuchungen zum Einfluß von Kotbestandteilen.................................100
V. Diskussion........................................................101
VI. Zusammenfassung...........................................117
VII. Summary...........................................................119
VIII. Referenzen......................................................121
Danksagung..............................................................135
Lebenslauf................................................................136
Selbständigkeitserklärung....................................137
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