Untersuchungen zur Rolle von microRNA in der Plasmazelldifferenzierung und dem multiplen Myelom:
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UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE VON MICRORNAS
IN DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG
UND
DEM MULTIPLEN MYELOM
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET
ERLANGEN-NUERNBERG
ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DR. RER. NAT.
VORGELEGT VON
MARTINA PORSTNER
AUS NUERNBERG
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1017139229
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALT
1 Z U S A M M E N F A S S U NG 11
2 S U M M A R Y .. 12
3 EINLEITUNG 13
3.1 HUMORALE IMMUNITAET UND PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 13
3.1.1 ALLGEMEINE VORGAENGE WAEHREND DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 13
3.1.2 TRANSKRIPTIONELLE VORGAENGE WAEHREND DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG
19
3.2 MULTIPLES MYELOM 24
3.2.1 GESCHICHTE DER ENTDECKUNG DES MULTIPLEN MYELOMS 24
3.2.2 PATHOGENESE DES MULTIPLEN MYELOMS 26
3.2.3 THERAPEUTISCHE ANSAETZE 31
3.3 MICRORNAS 33
3.3.1 BIOGENESE UND FUNKTION VON MICRORNAS 34
3.3.2 MIRNAS IN DER B-ZELLDIFFERENZIERUNG UND AKTIVIERUNG 37
3.3.3 MIRNAS IM MULTIPLEN MYELOM 40
4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 45
5 ERGEBNISSE 47
5.1 ISOLATION VERSCHIEDENER HUMANER UND MURINER B-ZELLSTADIEN 47
5.1.1 AUFREINIGUNG HUMANER B-ZELLSTADIEN 47
5.1.1.1 SORTIERUNG NAIVER B-ZELLEN AUS DEM PERIPHEREN VENOESEN BLUT 47
5.1.1.2 SORTIERUNG VON PLASMABLASTEN AUS DEM PERIPHEREN VENOESEN VOLLBLUT
48
5.1.1.3 ISOLIERUNG VON HUMANEN KNOCHENMARKS-PLASMAZELLEN 50
5.1.1.4 PHAENOTYPISCHE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN NORMALEN UND MALIGNEN
KNOCHENMARKS- PLASMAZELLEN 51
5.1.1.5 CHARAKTERISIERUNG HUMANER B-ZELLLINIEN 54
5.1.2 ISOLATION MURINER PLASMAZELLEN AUS KNOCHENMARK UND MILZ 56
5.2 MIRNOM HUMANER UND MURINER B-ZELLSTADIEN 57
5.2.1 DEEP SEQUENCING ANALYSE UND AUSWERTUNG MIT DEM MIRANATYZER 57
5.2.2 HUMANE MIRNA-PROFILE 58
5.2.2.1 REGULIERTE MIRNAS BEI DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 61
5.2.2.2 DEREGULIERTE MIRNAS IM MULTIPLEN MYELOM 75
5.2.2.3 MIRNA-SIGNATUREN DER ANALYSIERTEN PRIMAEREN ZELLPOPULATIONEN 84
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.3 MURINE MIRNA-PROFILE VON FOLLIKULAEREN B-ZELLEN UND PLASMAZELLEN 96
5.2.3.1 REGULIERTE MIRNAS BEI DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 99
5.2.3.2 AUTOIMMUNITAETS-ASSOZIIERTE MIRNAS MIT DIFFERENTIELLER EXPRESSION
IN KNOCHENMARKS- PLASMAZEBEN AUS NZB/WUND C57BU6 MAEUSEN 106
5.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE DER MIR-148A IN DER
PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 109
5.3.1 ANALYSEN ZUR EXPRESSION DER MIR-148A 109
5.3.1.1 MIR-148A EXPRESSION IN HUMANEN B-ZELLSTADIEN 109
5.3.2 MIR-148A ZIELGEN-ANALYSE 118
5.3.2.1 IN SILICO ANALYSE VON MIR-148A ZIELSTMKTUREN 118
5.3.2.2 IN VITRO ANALYSE VON VORHERGESAGTEN ZIELSTNJKTUREN DER MIR-148A
MITTELS DUALEM
LUZIFERASE-ASSAY 119
5.3.2.3 ZIELGEN-ANALYSE NACH MIR-148A OBEREXPRESSION IN HUMANER
B-ZELLLINIE 120
5.3.3 FUNKTIONELLE STUDIEN ZURMIR-148A IN PRIMAEREN LPS-BLASTEN 123
5.3.3.1 ZIELGEN-ANALYSE NACH MIR-148A UEBEREXPRESSION IN MURINEN
LPS-SBMULIERTEN MILZ-B- ZELLEN 124
5.3.3.2 ANALYSE DES ZELLWACHSTUMS VON LPS-BLASTEN NACH MODULIERTER
MIR-148A EXPRESSION
126
5.3.3.3 ZELLDIFFERENZIERUNG NACH MIR-148A UEBEREXPRESSION UND KNOCK-DOWN
IN PRIMAEREN LPS- BLASTEN 127
5.3.3.4 IGM-SEKRETIONSVERHALTEN NACH MODULATION DER MIR-148A EXPRESSION
IN LPS-BLASTEN 130
* DISKUSSION 131
6.1 MIRNA-PROFILE VON VERSCHIEDENEN B-ZELLSTADIEN 132
6.1.1 ALLGEMEINE UNTERSCHIEDE UND GEMEINSAMKEITEN DER MIRNA-PROFILE 132
6.1.2 IN PLASMAZELLEN DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE MIRNAS 135
6.1.3 IM MULTIPLEN MYELOM DEREGULIERTE MIRNAS 142
6.2 DIE ROLLE DER MIR-148A IN DER DIFFERENZIERUNG VON B-ZELLEN ZU
ANTIKOERPER- SEZEMIERENDEN ZELLEN 144
6.2.1 MIR-148A ALS MARKERFUER ANTIKOERPER-SEZERNIERENDE ZELLEN 144
6.2.2 DIE ROLLE DER MIR-148A WAEHREND DER PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG 145
6.2.2.1 BEENDIGUNG DER KEIMZENTRUMSREAKTION DURCH EINE
MIR-148A-VERMITTELTE, NEGATIVE
REGULATION VON BACH2 UND MITF 145
6.2.2.2 NEGATIVE REGULATION VON BIM (BCL2L11) 150
6.2.2.3 EINFLUSS DER MIR-148A AUF EPIGENETISCHE REGULATIONEN 151
MATERIAL UND METHODEN 155
7.1 MATERIAL 155
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
7.1.1 CHEMIKALIEN 155
7.1.2 VERBRAUCHSMATERIAL 156
7.1.3 GERAETE 157
7.1.4 KOMMERZIELLE KITS 158
7.1.5 LOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 159
7.1.6 ANTIKOERPER 159
7.1.7 OLIGOS 161
7.1.8 SIRNAS UND LNA SONDEN 161
7.1.9 PLASMIDE 161
7.2 VERWENDETE ORGANISMEN UND ANZUCHTBEDINGUNGEN 165
7.2.1 E. COFH STAMME UND KUTTURBEDINGUNGEN 165
7.2.2 VERTEBRALEN-ZELLLINIEN UND KULTURBEDINGUNGEN 166
7.2.2.1 VERWENDETE NAEHRMEDIEN 166
7.2.2.2 VERWENDETE ZELLLINIEN 166
7.2.3 MAUS-STAEMME 167
7.3 METHODEN 168
7.3.1 ZELLKULTURVERFAHREN 168
7.3.1.1 KULTIVIERUNG UND ERNTEN VON ZELLEN 168
7.3.1.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 168
7.3.1.3 AUFTAUEN VON ZELLEN 168
7.3.1.4 BESTIMMUNG DER ZELLDICHTE 168
7.3.1.5 FICOLL 169
7.3.1.6 ISOLATION VON PRIMAEREN B-LYMPHOZYTEN AUS DEM KNOCHENMARK UND DER
MILZ VON
MAEUSEN 169
7.3.1.7 LYSE DER ERVTHROZYTEN 169
7.3.1.8 AUFREINIGUNG VON MURINEN CD19* KNOCHENMARKS- UND CD43
MILZZELLEN 170
7.3.1.9 AUFREINIGUNG VON PRIMAEREN B-LYMPHOZYTEN AUS DEM BLUT ODER DEM
KNOCHENMARK VON
MENSCHLICHEN SPENDERN 170
7.3.2 TRANSFEKTION VON SAEUGETIER-ZELLEN 171
7.3.2.1 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ADHAERENTEN ZELLEN MIT DER
CALCIUMPHOSPHAT-METHODE ..171
7.3.2.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION ADHAERENTER ZELLEN DURCH LIPOFEKTION 172
7.3.3 RETROVIRALE TRANSDUKTION 173
7.3.3.1 GEWINNUNG RETROVIRALER PARTIKEL MITTELS TRANSIENTER TRANSFEKTION
173
7.3.3.2 RETROVIRALE TRANSDUKTION VON ZELLLINIEN 174
7.3.3.3 RETROVIRALE TRANSDUKTION VON VORAKTIVIERTEN CD43 -MILZZELLEN 174
7.3.3.4 DUALER LUZIFERASE ASSAY 174
7.3.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 175
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
7.3.4.1 ANALYSE VON OBERFLAECHENMOLEKUELEN UND INTRAZELLULAEREN PROTEINEN
175 7.3.4.2 SORTIERUNG VON ZELLPOPULATIONEN MITTELS MOFLO* 175
7.3.4.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG MIT FLOW-COUNT FLUORESPHERES 176
7.3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 176
7.3.5.1 TRANSFORMATION VON E. COLI NACH DER CALCIUMCHLORID-METHODE 176
7.3.5.2 TRANSFORMATION VON E. COLI DURCH ELEKTROPORATION 177
7.3.5.3 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA UND ZELLULAERER RNA 178
7.3.5.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON NUKLEINSAEUREN 178
7.3.5.5 ANALYTISCHE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN 179
7.3.5.6 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 179
7.3.5.7 RESTRIKTIONSENDONUKLEOLYTISCHE SPALTUNG VON DNA 179
7.3.5.8 LIGATION VON DNA 180
7.3.5.9 CDNA SYNTHESE 180
7.3.5.10 AMPLIFIKATION VON MATRIZEN-DNA MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 180
7.3.5.11 QUANTITATIVE ANALYSE VON MIRNAS MITTELS TAQMAN -QRT-PCR 181
7.3.5.12 NACHWEIS VON IGM MITTELS ELISA 182
7.3.5.13 GEWINNUNG VON ZELLLYSATEN 182
7.3.5.14 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 182
7.3.5.15 WESTEM-BLOT-ANALYSE 183
7.3.5.16 NORTHERN-BLOT-ANALYSE KLEINER RNA MOLEKUELE 183
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 189
9 LITERATURVERZEICHNIS 192
10 LEBENSLAUF 214
PUBLIKATIONEN 215
DANKSAGUNG........**** * * * * * * * * . . * * * * * * * * * * * . * * *
* * * * .* * * * . * * . . . . .. ** . . . . . . . . . . * * * . . . * *
* * . ** 2 16
ERKLAERUNG 217
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