Charakterisierung und funktionelle Analyse DPC4-Smad4-interagierender Proteine:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis IV
Inhaltsverzeichnis IV
Abkürzungen VII
1 Einleitung 1
1.1 Der TGFß Signalweg 1
1.1.1 TGFß Liganden und Rezeptoren 1
1.1.2 Biologische Funktion 3
1.1.3 Die Rolle von TGFß bei Neoplasien 3
1.2 Smad s - Die Vermittler im TGFß Signalweg 5
1.2.1 Die Smad Proteine 5
1.2.2 Strukturelle Eigenschaften 6
1.2.3 Das Tumorsuppressor-Gen DPC4/Smad4 7
1.2.4 Smad Komplexe und Genregulierung 9
1.2.5 Direkte DNA Bindung durch Smad Proteine 9
1.2.6 Interaktion mit Transkriptions Ko-Aktivatoren und Ko-Repressoren 11
1.2.7 Crosstalk/Wechselwirkungen mit anderen Signalwegen 15
1.3 Identifizierung potentieller DPC4/Smad4-Interaktionspartner 18
1.3.1 Fragestellung 19
2 Material und Methoden 20
2.1.1 Verbrauchsmaterialien 20
2.1.2 Chemikalien, Lösungen und Puffer 20
2.2 Plasmide 24
2.2.1 Bakterienstamm und Kulturmethode 24
2.2.2 Elektrotransfektion 24
2.2.3 Plasmid-Konstrukte 25
2.2.4 Plasmid-DNA Präparation 27
2.2.5 Endo-Free Plasmid-DNA Präparation 27
2.2.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren! 28
2.2.7 Restriktionsanalyse 28
2.2.8 Elektrophoretische Auftrennung der DNA im Agarosegel 28
2.2.9 Cycle Sequencing 29
2.2.10 Automatische Sequenzierung 30
Inhaltsverzeichnis V
2.3 Zellkultur 31
2.3.1 Zelllinien 31
2.3.2 Mycoplasmen Nested-PCR 32
2.3.3 Transfektion 32
2.3.4 Liposomen-vermittelte Transfektion 33
2.3.5 Transiente Transfektion mit DEAE-Dextran 34
2.4 In-vitro Transkription und Translation 35
2.4.1 Proteinauftrennung durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 35
2.4.2 Expression eines rekombinanten Fusionsproteins in E.coli 36
2.4.3 GST-Fusionsprotein Aufreinigung, GST-Pull-down-Assay 38
2.4.4 Aufreinigung von rekombinantem Fusionsprotein mit His-Tag 39
2.4.5 In-vitro Protein-Protein Interaktionstest (His-Tag Pull-down) 40
2.4.6 Immunoblot (Western-Blot) 41
2.5. Reportergen Technologie 42
2.5.1 Luciferase Assay 43
2.5.2 Galaktosidase-Assay, chemoluminometrisch 43
2.5.3 Galaktosidase-Assay, kolorimetrisch 44
2.5.4 Bradford-Proteinmengenbestimmung 44
2.5.5 Auswertung 45
3 Ergebnisse 46
3.1 Analyse der Kandidatengene im Pull-down 46
3.1.1 D400 Pull-down Experiment 46
3.1.2 RAC3 Pull-down Experiment 47
3.2 Etablierung des Reportergen-Assays 48
3.2.1 Transfektionseffizienz und Reportertest in Karzinomzelllinien 48
3.2.2 Evaluierung verschiedener Transfektionsbedingungen 52
3.2.3 Evaluierung verschiedener DNA-Präparationstechniken 53
und Transfektionsagenzien
3.3 Funktionelle Analyse der Kandidatengene im Reportergen-Assay 56
3.3.1 D400 56
3.3.2 RAC3 61
3.4 Sequenzvergleich D400 vs. Smad4-interacting transcription factor 66
Inhaltsverzeichnis VI
4 Diskussion 69
4.1 Charakterisierung der Kandidatengene im Pull-down 69
4.2 Methodische Probleme der Transfektion 70
4.3 Methodische Probleme der Reportergen-Analysen 71
4.4 Charakterisierung der Kandidatengene im Reportergen-Assay 73
4.4.1 D400 73
4.4.2 RAC3 77
5 Zusammenfassung 81
Literaturverzeichnis 83
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis IV
Inhaltsverzeichnis IV
Abkürzungen VII
1 Einleitung 1
1.1 Der TGFß Signalweg 1
1.1.1 TGFß Liganden und Rezeptoren 1
1.1.2 Biologische Funktion 3
1.1.3 Die Rolle von TGFß bei Neoplasien 3
1.2 Smad's - Die Vermittler im TGFß Signalweg 5
1.2.1 Die Smad Proteine 5
1.2.2 Strukturelle Eigenschaften 6
1.2.3 Das Tumorsuppressor-Gen DPC4/Smad4 7
1.2.4 Smad Komplexe und Genregulierung 9
1.2.5 Direkte DNA Bindung durch Smad Proteine 9
1.2.6 Interaktion mit Transkriptions Ko-Aktivatoren und Ko-Repressoren 11
1.2.7 Crosstalk/Wechselwirkungen mit anderen Signalwegen 15
1.3 Identifizierung potentieller DPC4/Smad4-Interaktionspartner 18
1.3.1 Fragestellung 19
2 Material und Methoden 20
2.1.1 Verbrauchsmaterialien 20
2.1.2 Chemikalien, Lösungen und Puffer 20
2.2 Plasmide 24
2.2.1 Bakterienstamm und Kulturmethode 24
2.2.2 Elektrotransfektion 24
2.2.3 Plasmid-Konstrukte 25
2.2.4 Plasmid-DNA Präparation 27
2.2.5 Endo-Free Plasmid-DNA Präparation 27
2.2.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren! 28
2.2.7 Restriktionsanalyse 28
2.2.8 Elektrophoretische Auftrennung der DNA im Agarosegel 28
2.2.9 Cycle Sequencing 29
2.2.10 Automatische Sequenzierung 30
Inhaltsverzeichnis V
2.3 Zellkultur 31
2.3.1 Zelllinien 31
2.3.2 Mycoplasmen Nested-PCR 32
2.3.3 Transfektion 32
2.3.4 Liposomen-vermittelte Transfektion 33
2.3.5 Transiente Transfektion mit DEAE-Dextran 34
2.4 In-vitro Transkription und Translation 35
2.4.1 Proteinauftrennung durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 35
2.4.2 Expression eines rekombinanten Fusionsproteins in E.coli 36
2.4.3 GST-Fusionsprotein Aufreinigung, GST-Pull-down-Assay 38
2.4.4 Aufreinigung von rekombinantem Fusionsprotein mit His-Tag 39
2.4.5 In-vitro Protein-Protein Interaktionstest (His-Tag Pull-down) 40
2.4.6 Immunoblot (Western-Blot) 41
2.5. Reportergen Technologie 42
2.5.1 Luciferase Assay 43
2.5.2 Galaktosidase-Assay, chemoluminometrisch 43
2.5.3 Galaktosidase-Assay, kolorimetrisch 44
2.5.4 Bradford-Proteinmengenbestimmung 44
2.5.5 Auswertung 45
3 Ergebnisse 46
3.1 Analyse der Kandidatengene im Pull-down 46
3.1.1 D400 Pull-down Experiment 46
3.1.2 RAC3 Pull-down Experiment 47
3.2 Etablierung des Reportergen-Assays 48
3.2.1 Transfektionseffizienz und Reportertest in Karzinomzelllinien 48
3.2.2 Evaluierung verschiedener Transfektionsbedingungen 52
3.2.3 Evaluierung verschiedener DNA-Präparationstechniken 53
und Transfektionsagenzien
3.3 Funktionelle Analyse der Kandidatengene im Reportergen-Assay 56
3.3.1 D400 56
3.3.2 RAC3 61
3.4 Sequenzvergleich D400 vs. Smad4-interacting transcription factor 66
Inhaltsverzeichnis VI
4 Diskussion 69
4.1 Charakterisierung der Kandidatengene im Pull-down 69
4.2 Methodische Probleme der Transfektion 70
4.3 Methodische Probleme der Reportergen-Analysen 71
4.4 Charakterisierung der Kandidatengene im Reportergen-Assay 73
4.4.1 D400 73
4.4.2 RAC3 77
5 Zusammenfassung 81
Literaturverzeichnis 83 |
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