Eignung von "enhanced green fluorescent protein" als Reporterprotein in Säugerzellen für die Bestimmung des zytotoxischen Potentials von UV-Strahlung:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
_
_
1.1
S
OLARE
UV-S
TRAHLUNG
UND
O
ZONLOCH
.
11
1
.2
G
ESUNDHEITSEFFEKTE
DURCH
UV-E
XPOSITION
.
12
1.3
W
IRKUNG
VON
UV-S
TRAHLUNG
AUF
ZELLULAERER
E
BENE
.
17
13.1
UV
INDUZIERTE
DNA-SCHAEDEN
UND
REPARATURMECHANISMEN.
.
17
1.3.2
DAS
ONKOGEN/ANTIONKOGEN
KONZEPT
.
21
1.3.3
REGULATIONSMECHANISMEN
DES
ZELLZYKLUS
.
22
1.4
D
IE
E
NTWICKLUNG
VON
B
IOASSAYS
.
24
1.4.1
ENTWICKLUNG
EINES
TESTSYSTEMS
ZUR
UNTERSUCHUNG
ZELLULAERER
VORGAENGE
NACH
BESTRAHLUNG
MIT
DEM
REPORTERGEN
GFP
.26
1.4,2
CHO
ZELLEN
ALS
DEFINIERTE
MUTANTEN
.29
1.5
F
RAGESTELLUNG
.
29
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
31
2.1
C
HEMIKALIEN
.
31
2.2
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
31
2.2.1
PLASMIDE
.31
2.2.1.1
PGFP-NL
VEKTOR
.
32
2.2.1.2
PCX-GFP
VEKTOR
.
33
2.2.1.3
PSV2NEO
.
33
2.2.2
GEWINNUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMID
DNA
.
34
2.2.2.
1
ANZUCHT
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
VON
E.
COLI
JM83
BZW.
DH5A
.
34
2.2.2.2
TRANSFORMATION
MIT
VEKTOREN
.35
2.2.2.3
ANZUCHT
UND
ERNTE
.
35
2.2.2.4
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PUC19-PLASMID-DNA
.35
2.2.2.5
ZELL-LYSE
.35
2.2.2.OE
FAELLUNG
DER
ZELLTRUEMMER
.37
2.2.2.7
REINIGUNG
DER
PLASMID-DNA
.
37
2.2.2.8
CHARAKTERISIERUNG
DER
PLASMID-DNA
.
38
2.3
Z
ELLKULTUR
.
39
2.3.1
VERWENDETE
ZELLINIEN
.39
2.3.2
MATERIALIEN
.40
2.3.2.1
PLASTIKMATERIAL
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
40
2.3.2.2
ZELLKULTURMEDIUM
UND
GEBRAUCHSLOESUNGEN.
40
2.3.3
ROUTINEMETHODEN
.
40
2.3.3.1
KULTURBEDINGUNGEN
.
40
2.3.3.2
KULTIVIEREN
DER
ZELLEN
.43
2.3.3.3
LICHTMIKROSKOPISCHE
DOKUMENTATION.43
2.3.3.4
WACHSTUMSKINETIK
WAEHREND
EINER
PASSAGE
.
43
2.3.3.5
GEFRIERKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN
.43
2.3.4
GENTECHNISCHE
METHODEN
IN
DER
ZELLKULTUR
.
44
2.3.4.1
TRANSFEKTION
.
44
2.3.5
NACHWEIS
DER
GFP-EXPRESSION
IN
LEBENDEN
UNDFIXIERTEN
SAEUGERZELLEN
.
49
2.3.5.1
PRAESERVATION
VON
EGFP
NACH
VERSCHIEDEN
FIXIERUNGSPROTOKOLLEN.50
2.3.5.2
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
VISUALISIERUNG
VON
EGFP
.
51
2.3.5.3
FLUOREZENZSPEKTROSKOPIE
.
51
2.3.5.4
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
ZUM
NACHWEIS
DER
EGFP
UND
PL-FLUORESZENZ
.
51
2.3.6
EXPERIMENTE
ZUR
UV-SENSIBILITAET
VON
SAEUGERZELLEN.
.56
2.3.6.1
UVC-BESTRAHLUNG
.56
2.3.6.2
KOLONIEBILDUNGSTEST
(COLONY
FORMING
ABILITY,
CFA)
.56
2.3.6.3
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
ZUR
ANALYSE
DER
ZELLEN
NACH
BESTRAHLUNG
.59
3
ERGEBNISSE
----------------------------------------------------------------------------------------------------
62
3.1
C
HARAKTERISIEREN
DER
P
LASMID
-DNA
.
62
3.1.1
PHOTOMETRISCHE
MESSUNGEN
.62
3.1.2
QUALITATIVE
DNA-ANALYSE
.63
3.2
Z
ELLKULTUR
.
64
3.2.1
WACHSTUMSKINETIK.64
3.2.2
ANALYSE
DER G418-SENSITIVITAET
DER
LINIEN
AA8
UND
UV5
.66
3.2.3
TRANSFEKTIONSERGEBNISSE
.67
3.2.4
VISUALISIERUNG
VON
GFP-EXPRESSION
IN
SAEUGERZELLEN
.
68
3.2.4.1
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
.
68
3.2.4.2
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
.
70
3.2.4.3
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
74
3.2.5
UV-SENSIBILITAET
VON
SAEUGERZELLEN.
.
.
.
.80
3.2.5.1
ZELLULAERES
UEBERLEBEN
NACH
BESTRAHLUNG
(KOLONIEBILDUNGSFAEHIGKEIT)
.
80
3.2.5.2
EGFP-EXPRESSION
NACH
UVC-BESTRAHLUNG
.
81
3.2.S.3
ZELLZYKLUSANALYSE
NACH
UVC-BESTRAHLUNG
.87
4
DISKUSSION
_
93
4.1
B
ESTIMMUNG
DES
EGFP
V
EKTORS
.
93
4.1.1
ENTWICKLUNG
DER
EGFP-EXPRIMIERENDEN
ZELLINIEN
AA8-PGFP
UND
UV5-PGFP^.
.
95
4.1.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
OPTIMALEN
EGFP
UND
DNA
FIXIERUNG
UND
MARKIERUNG
ZUR
FACS-ANALYSE
.96
4.1.3
EGFP
ANREGUNGS
UND
EMISSIONSSPEKTRUM
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLLINIEN
.
98
4.1.4
DURCHFIUSSZYTOMETRISCHE
DARSTELLUNG
DER
TRANSFIZIERTEN ZELLINIEN
AA8-PGFP
UND
UV5-PGFP
.
99
4.1.5
STABILITAET
DES
EGFP
NACH
INKUBATION
MIT
CYCLOHEXIMID
.99
4.1.6
VERGLEICH
DER
UV-STRAHLENSENSIBILITAET
TRANSFIZIERTER
UND
NICHT-TRANSFIZIERTER
ZELLEN
MIT
DEM
KOLONIEBILDUNGSTEST
.
101
4.1.7
EGFP-EXPRESSION
NACH
UVC-BESTRAHLUNG
.102
4.1.8
HYDROXYHAMSTOFF
.103
4.2
Z
ELLZYKLUSANALYSE
NACH
B
ESTRAHLUNG
MIT
UVC
.
103
4.2.1
ZELLZYKLUSANALYSE
.
103
4.2.2
RUECKSCHLUESSE
DER
ZELLZYKLUSANALYSE
AUF
DIE
ZUVOR
BESCHRIEBENEN
EFFEKTE
DER
UVC-BESTRAHLUNG
AUF
DIE
EGFP-FLUORESZENZ
.
104
4.3
A
USBLICK
.
105
S
ZUSAMMENFASSUNG
6
LITERATURVERZEICHNIS
_
.
_
.
_
.
_
.
_
.
_
108
7
VORABVEROEFFENTLICHUNGEN
--------------------------------------------------------------------------------------
119
8
LEBENSLAUF
_
.
-----------------
------------------------------------------------
121
8 |
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