Analyse der T-Zell-Antwort bei Patienten mit hormonrefraktärem Prostatakarzinom vor und nach allogener Tumorzellvakzinierung:
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Autor: Osthoff, Michael Friedrich
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Das Prostatakarzinom 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.2 Ätiologie 1
1.1.3 Klinische Symptomatik und Diagnosestellung 3
1.1.4 Therapieoptionen 4
1.2 Das menschliche Immunsystem 6
1.2.1 Immunosurveillance 7
1.2.2 Aufbau und Funktionsweise des Immunsystems 8
1.2.3 Aufbau des T-Zell-Rezeptors 10
1.2.4 Antigenerkennung durch T-Lymphozyten 13
1.3 Die Antitumorvakzinierung 17
1.3.1 Zielsetzung der Antitumorvakzinierung 17
1.3.2 Eigenschaften von Antitumorvakzinen 20
1.3.3 Antitumorvakzinierungsstrategien beim
Prostatakarzinom 23
1.4 Die Überwachung der Immunantwort im
Rahmen der Antitumorvakzinierung 24
1.4.1 Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp 25
1.4.2 Methoden der/n-wfro-Analyse 26
1.5 Zytokinbasierte Gentherapie beim
Prostatakarzinom 29
; 1.6 Zielsetzung 31
I
INHALTSVERZEICHNIS
2. Material 33
2.1 Geräte und Verbrauchsmaterial 33
2.2 Chemikalien 35
2.3 Zellkultur 36
2.3.1 Verbrauchsmedien, Zusätze und andere Reagenzien 36
2.3.2 Medien 37
2.4 Blut- und Serumproben 38
2.5 Gewebeproben 40
2.6 Zelllinien 40
2.7 Antikörper 41
2.8 Peptide 42
2.9 Reagenziensysteme 43
2.9.1 Reagenziensysteme für das ß/o-P/ex®-Gerät 43
2.9.2 Reagenziensysteme für den Cytometric Bead Array 44
2.9.3 Reagenziensysteme für den IFN-y-ELISPOT 44
2.10 Molekularbiologie 45
2.10.1 Oligonukleotide 45
2.10.2 Enzyme 49
2.10.3 Reagenziensysteme 49
2.10.4 Sonstige Reagenzien 50
2.11 Personen-und Herstellerverzeichnis 51
3. Methoden 54
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1 Allgemeine Methoden der Zellkultur 54
3.1.1 Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren
Blutes (PBMC) 54
3.1.2 Bestimmung der Zellzahl 55
3.1.3 Einfrieren von Zellen 55
3.1.4 Auftauen von Zellen 56
3.1.5 Kultivierung und Passagierung adhärenter
Tumorzellen 56
3.1.6 Isolierung und Kultivierung von gewebeinfiltrierenden
Lymphozyten 57
j
3.1.7 Stimulation von PBMC/TIL mit der Vakzinezelllinie 57
3.2 Simultane Messung multipler Zytokine
(multiplexing) 58
3.2.1 Vorbereitung 58
3.2.2 Prinzip der Zytokinmessung mit dem Bio-Plex ®-Gerät 59
3.2.2.1 Durchführung 60
3.2.2.2 Auswertung 62
3.2.3 Prinzip der Zytokinmessung mit Hilfe des CBA Kit 62
3.3 Methoden der Molekularbiologie 64
3.3.1 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 64
3.3.2 RNA-Isolierung aus Zellen 64
3.3.2.1 TriReagent Methode 65
3.3.2.2 RNeasy Kit 66
3.3.3 Reverse Transkription 66
3.3.3.1 Superscript System 66
3.3.3.2 AMV Reverse Transkriptase System 67
3.3.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 68
III
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.5 Quantitative real-time PCR mit Hilfe des LightCyclei®-
Gerätes 70
3.3.5.1 Prinzip 70
3.3.5.2 Durchführung 71
3.3.5.3 Auswertung 73
3.3.6 Gelelektrophorese 75
3.3.7 DNA-Seqijenzanalyse 78
3.4 ELISPOT 78
3.4.1 Prinzip 78
3.4.2 Durchführjjrvg 79
4. ErgebnissIe- 82
4.1 Tcr-Repertoire-Analysen 82
4.1.1 Amplifikation von TCR mittels familienspezifischer
Primer 82
4.1.2 TCR-Repertoire von PBL 85
4.1.3 TCR-Repertoire von PBL nach /n-wf/ü-Stimulation mit
der allogenen Prostatakarzinom-vakzine 86
4.1.4 TCR-Repertoire der TIL des Patienten 109 92
4.1.5 TCR-Repertoire am Vakzinierungsort der Patienten
113, 182 und 184 97
4.2 sequenzierung dominanter tcr
4.3 Charakterisierung des Tcr-Repertoires
peripherer t-lymphozyten im verlauf der
Vakzinierung 103
4.4 analyse des zytokinmilieus am ort der
vakzinierung 107
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.5 multiplexe zytokinbestimmungen im serum
der Patienten 110
4.6 Detektion Peptid-spezifischer, lFN-r-
PRODUZIERENDER T-ZELLEN 115
5. Diskussion 123
5.1 Tcr-Repertoire-Analysen nach Mltc-
experimenten mit der vakzinezelllinie 125
5.2 Tcr-Repertoire von Til des Patienten 109 129
5.3 Tcr-Repertoire am Vakzinierungsort 133
5.4 Analyse dominanter Tcr und molekulares
Tracking während der Vakzinierung 135
5.5 Analyse des Zytokinmilieus am Ort der
Vakzinierung 141
5.6 multiplexe zytokinbestimmungen im serum
der Patienten 149
5.7 Immune Monitoring mit Hilfe des Elispot-
Assays 154
6. Zusammenfassung 165
7. Literaturverzeichnis 170
8. Abkürzungsverzeichnis 203
9. Danksagung 206
V
INHALTSVERZEICHNIS
10. Lebenslauf 208
11. Anhang 210
11.1 Studiendesign 211
11.2 Vakzinepräparation und-Applikation 216
11.3 Monitoring 216
VI
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